ПРИГОТОВЛЕНИЕ БУФЕРНЫХ СМЕСЕЙ, КОЛОНОК, СИЛИКАГЕЛЬНЫХ ПЛАСТИНОК  

Способность раствора противостоять прибавлению кислоты или щелочи называется его буферной емкостью. Выражается она числом эквивалентных масс кислоты или щелочи, которые нужно прибавить к 1 мл раствора, чтобы его pH изменился на единицу. Для большинства буферных смесей интервал pH, в котором они обладают достаточным буферным действием, не превышает 2. Чтобы расширить этот интервал, пользуются буферными смесями, состоящими из нескольких слабых кислот и их солей, подобранных с таким расчетом, чтобы там, где кончается область буферного действия одной из них, начиналась область другой. Такие буферные смеси называются универсальными.

Буферные растворы готовят согласно разработанным рецептам. Исходные растворы для буферных смесей приготавливают особенно тщательно. Так, раствор ЫаОН не должен содержать соды. Для этого 100 г х. ч. №ОН растворяют в 120 мл воды и сливают в цилиндр, плотно закрытый пробкой. В таком концентрированном растворе сода не растворяется и выпадает в осадок. Затем раствор осторожно декантируют и разводят до требуемой концентрации.

Буферные растворы готовят на дистиллированной воде, из которой при кипячении (в течение 30—45 мин) удален С02, и хранят в сосудах с хлоркальциевой трубкой для предохранения от доступа С02 из воздуха.

Использование сефадекса в гель-фильтрации.

Молекулярная масса разделяемых полисахаридов

У белковых веществ диапазоны молекулярных масс шире, чем у полисахаридов.

Для использования сефадекса служит хроматографическая колонка из боросиликатного стекла с рубашкой. Вначале сефадекс смешивают с водой, полученную смесь взмучивают, вливают в колонку и дают осесть. Затем в колонку добавляют концентрированный раствор исследуемого вещества так, чтобы не взмучивался верхний слой сефадекса. Равновесие устанавливается быстро, скорость вымывания значительно выше по сравнению с обычными ионитами. Фракции контролируют спектрофотометрически или по электропроводности.

Приготовление силикагеля и пластинок для метода тонкослойной хроматографии (ТСХ). Метод ТСХ имеет ряд преимуществ перед другими методами хроматографического анализа (колоночной хроматографии и хроматографии на бумаге): вещества разделяются быстро — от нескольких минут до 2—3 ч; можно разделять малые количества вещества (0,1—0,05 мкг), а также выделять их препаративно (от 100 до 500 мг). Основан метод на сорбции растворенных веществ адсорбентом; при движении растворителя с разделяемой смесью веществ по неподвижной фазе — адсорбенту разделяемые компоненты перемещаются с различной скоростью в направлении движения растворителя. В качестве сорбентов применяют целлюлозу, А12О3, кизельгур и др. Наибольшее применение получил силикагель — соединение общей формулы БЮг • яН20.

Адсорбционные свойства силикагеля могут быть существенно изменены добавлением кислот, оснований, солей.

Для разделения липидов на отдельные фракции применяют марки силикагеля в, Н, ОС, Ь, КСК гранулированный и др.

Подготовка силикагеля марки КСК. При отсутствии специально предназначенных для тонкослойной хроматографии силикагелей рекомендуют продажный гранулированный или кусковой силикагель марки КСК или ШСК. Для этого кусковой силикагель измельчают на шаровой мельнице и пропускают с водой через сито. Через 30 мин воду удаляют декантацией, а осадок промывают сначала горячей водой, затем горячим этанолом, опять водой и концентрированной соляной кислотой до приобретения фильтратом светло-желтой окраски. Отмывают водой до отрицательной реакции на ионы хлора (помутнение 1—0,1%-ного раствора серебра нитрата). На ионы железа проверяют с роданидом аммо- нидом (калия, натрия). Отмытый силикагель сушат при 120—130 °С в течение 5—6 ч и просеивают через сита с размером ячеек 150—200 мкм. Хранят в банках с притертыми пробками.

Приготовление ТСХ-пластинок с закрепленным слоем сорбента. При отсутствии в лаборатории специального аппликатора для нанесения слоя сорбента на хроматографические пластинки последние можно изготовить следующим образом. Просеянный через сито с отверстиями диаметром 150—200 мкм силикагель тщательно перемешивают с 6 % (по массе) чистого медицинского гипса или 1 % растворимого крахмала и наносят смесь на поверхность матированных с помощью наждачного порошка обезжиренных стеклянных фотопластинок (13 * 18 см). Толщина слоя сорбента, образуемого на пластинке, обеспечивается при разравнивании его стеклянной трубкой (диаметром 1,5—2 см), на которую на расстоянии 12 см друг от друга наматывают по нескольку витков проволоки диаметром 0,5 мм. Такие кольца служат ограничителями размера наносимого слоя, а также гарантируют его постоянную толщину (0,5 мм). Пластинки с нанесенным слоем сорбента размещают на строго горизонтальной поверхности и опрыскивают из пульверизатора дистиллированной водой до полного насыщения слоя. После подсушивания на воздухе (избегать пыли) пластинки помещают в сушильный шкаф и активируют при 105—110 °С в течение 1 ч или при 140 °С в течение 0,5 ч. Приготовленные таким образом пластинки хранят в эксикаторах над поглотителем (кальция хлорид). При длительном хранении пластинок их активность следует периодически проверять.

Если пластинки готовят для экспресс-метода, сорбент можно наносить на пластинку в виде жидкой взвеси силикагеля с гипсом или крахмалом в воде с помощью пипетки. Более или менее однородные по свойствам пластинки получают при нанесении одинаковых объемов такой взвеси на каждую пластинку. Отклонения от рекомендованных марок силикагелей и режимов их обработки допускаются в исключительных случаях.