ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ КАРТОФЕЛЯ В АКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

1/. А. ПРОЦЕН КО
Институг биохимии им. А. Н. Баха АН СССР
В последнее время внимание исследователей, работающих в области иммунитета растении, все больше привлекают белки. Однако работа в этом направлении встречает значительные методические трудности.

В настоящей статье мы ставим целью описать метод выделения и исследования белков картофеля, применяемый в нашей лаборатории. Этот метод был описан В. И. Сафоновым и М. П. Сафоновой [1, 2] и модифицирован нами для наших объектов.
Мы исследовали водорастворимую фракцию белков клубней картофеля. Как известно, ткани картофеля содержат значительное количество фенольных веществ, которые неблагоприятно действуют на белки, осаждая и денатурируя их. Поэтому мы вынуждены были принимать меры к устранению такого действия. Удовлетворительные результаты в этом направлении дало применение аскорбиновой кислоты в качестве составной части буферного раствора: трис (оксиметиламинометан) —18,41 г; аскорбиновая кислота — 10 г; версен (этилендиаминтетраацетат) — 40 .иг; вода — до 1 л; pH 8,6. Ткани клубней растирали в ступке и экстрагировали указанным буферным раствором в отношении 1:4 на холоду (5° С) при постоянном помешивании в течение 30 мин. Экстракт центрифугировали и пропускали через сефа- декс Г-25 (насыщенный тем же буферным раствором) для освобождения от низкомолекулярных веществ. Собирали фракцию, содержащую белок, наличие которого определяли по реакции осаждения с 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты. К полученному раствору белка прибавляли сернокислый аммоний до 75% насыщения и оставляли в холодильнике на 1 час. Затем смесь центрифугировали и осадок растворяли в воде, после чего раствор пропускали через сефадекс Г-25 (насыщенный водой) для освобождения от соли. Собирали содержащую белок фракцию, которую высушивали лиофильно. Дальнейшее исследование полученных препаратов проводили методом электрофореза в синтетическом полиакриламидном геле. Следует отметить, что полиакриламидный гель имеет ряд преимуществ перед другими носителями, применяемыми для электрофореза: постоянные свойства (размер пор, прочность и др.); электрически нейтрален, что облегчает работу с ним; прозрачен, что увеличивает разрешающую способность метода. В наших опытах был использован гель, приготовленный следующим образом.
Исходные растворы: А. 10%-ный водный раствор акрилампда, содержащий 0,3% метиленбисакриламида.
Б. Трис-цитратный буфер pH 8,6 (трис — 18,41 г; лимонная кислота — 1,92 г; вода — до 1 л).
Катализаторы: 1. 10%-ный раствор ?-диметиламинопропиони- трнла.
2. Насыщенный раствор надсернокислого калия.
Перед началом работы сливали равные объемы растворов А и Б и прибавляли на 100 мл полученной смеси 1 мл катализатора 1 и 1,13 мл катализатора 2. Смесь быстро разливали в формы, которые закрывались герметически для изоляции от кислорода воздуха, препятствующего полимеризации. Полимеризация длилась 4—6 час. при комнатной температуре.
Пластинки геля, использовавшиеся в наших опытах, имели размер 60 X 20 X 2 мм. Посередине пластинки был расположен канал диаметром 1 мм для нанесения испытуемого образца. Электрофорез проводили в течение 1 час. при силе тока 12,5 ма па 1 см2 сечения пластипки. Полученные электрофореграммы фиксировали 5%-ной трихлоруксусной кислотой, окрашивали кислотным спне-черным красителем и фотометрировали на микрофотометре МФ-4.
Кривые фотометрирования (рис. 1) показывают поглощение света различными участками электрофореграмм. Пики, отмеченные стрелками, соответствуют участкам, содержащим отдельные компоненты белковой фракции. Штриховкой отмечено место, соответствующее стартовому каналу.

Из рис. 1 видно, что изучаемые препараты содержат главным образом кислые белки. Воспроизводимость данных удовлетворительна, так как кривые фотометрирования электрофореграмм двух препаратов, полученных из тканей картофеля одного сорта, имеют сходный характер. На рис. 2 показаны аналогичные кривые, полученные при исследовании разных сортов картофеля. Из рисунка видно, что кривые фотометрирования электрофореграмм разных сортов значительно отличаются одна от другой и характерны для сорта.
Мы попыталпсь исследовать влияние различных воздействий (поранения, заражения Phytophthora infestans) на клубни картофеля. Для этого мы изучали описанным способом препараты белков, полученные из здоровых клубней, из тканей клубней, прилегающих к пораненным участкам (прнраневая ткань), из тканей, образовавшихся на месте поранения в результате залечивания (раневая ткань), и из тканей, прилежащих к зараженным Ph. infestans. Для получения более полного представления о составе белковых препаратов мы считали необходимым использо-
+
вать при электрофорезе две разных концентрации наносимого материала (рис. 3). Кривая 2, соответствующая меньшей концентрации, дает довольно четкую картину распределения компонентов анодной фракции. Кривая 1 (концентрация белка 100 мг/мл) отражает картину распределения компонентов катодной фракции. Таким образом, использование двух концентраций позволяет получить четкие электрофореграммы как в анодной, так и в катодной частях.
Из сопоставления кривых, показанных на рис. 3, следует, что в то время, как катодная фракция белков (концентрация 100 мг/мл) здоровой ткани содержит три четко выраженных компонента, та же фракция прираневой ткани содержит только один компонент. Белки раневой и прилежащей к зараженной тканей


2. Кривые фотометрирования электрофореграмм водорастворимых белкон картофеля различных
сортов
а — Любимец; б — Лорх; в — Олен;*г — Ранняя Роза





Рис. 3. Кривые фотометрирования электрофореграмм водорастворимых белков картофеля сорта Любимец
а _ нормальная ткань клубня; б — прнраневая ткань; в — раневая ткань; г — ткань, прилежащая к зараженной Рк. іп/еііаш;

1. — концентрация белка 100 мг/мл; 2 — 5 мг/мл

содержат также по одному компоненту катодной фракции, однако его количество несколько меньше, чем соответствующего компонента белков прираневой ткани.
Таким образом, препараты белка, полученные описанным выше способом, достаточно характерны для каждого сорта картофеля и обнаруживают определенные изменения при поранении и заражении их Рк. т^еэЬат.
ЛИТЕРАТУРА

1. В. И. Сафонов, М. П. Сафонова. Метод электрофореза белков рас

тений в синтетической среде — полиакрпламидпом геле. — Физиология растений, И. вып. 1, 1964.

2. В. И. Сафонов, М. П. Сафонова. Усовершенствованный метод элек

трофореза белков растений в полиакриламидном геле. — Физиология растений, И, вып. 6, 1964.

Еще по теме ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ КАРТОФЕЛЯ В АКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ:

1. ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВ КАРТОФЕЛЯ
2. Электрофорез
3. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ              ¦
4.   МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА  
5. ПРИЛОЖЕНИЯ РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ВРЕДОНОСНОСТЬ БОЛЕЗНЕЙ И ВРЕДИТЕЛЕЙ КАРТОФЕЛЯ В РАЗРЕЗЕ ЗОН 124 КРАТКИЙ ОПРЕДЕЛИТЕЛЬ НАИБОЛЕЕ ЧАСТО ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ БОЛЕЗНЕЙ И ПОВРЕЖДЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ПО ВНЕТТТНЛ11 ЙР ЗЗНАКАМ 126 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ЯДОХИМИКАТАМИ 135
6.   Определение белковых фракций в сыворотке крови. 
7. Структура и функции белков
8. 4.9. Определение белкового азота
9. Регуляция активности генов и белков
10.   БЕЛКОВЫЙ СОСТАВ СЫВОРОТКИ КРОВИ