1.1. Механизмы образования различных типов АФК

Кислород является важным компонентом газовой среды, необходимым для дыхания большинства живых организмов [67]. В основном состоянии молекулярный кислород является относительно стабильным, не способным спонтанно реагировать с другими соединениями, что определяется его структурой [140].

В аэробных организмах многие процессы проходят с участием кислорода. Так, в дыхательной цепи митохондрий происходит полное четырехэлектронное восстановление кислорода до воды. Однако возможен процесс его неполного одно-, двух- или трехэлектронного восстановления с образованием различных активных форм кислорода (АФК), что представляет опасность для организмов [21].

Известно, что при отсутствии экстремальных факторов концентрация АФК должна сохраняться на постоянном и достаточно низком уровне, и они при этом вовлекаются в нормальный метаболизм клеток [67]. К АФК относятся свободные радикалы, такие как супероксидный ОЩ, гидроксильный ОН\ гидропероксидный радикалы НО₂ , и нейтральные молекулы - пероксид водорода Н₂О₂, синглетный кислород ¹О₂, озон О₃.

В растительных клетках существует несколько механизмов образования различных типов АФК: неферментативный механизм,

связанный с неполным восстановлением молекулярного кислорода, и ферментативный механизм, обусловленный повышением активности ряда ферментов - липоксигеназ, пероксидаз, ди- и полиаминоксидаз, оксалатоксидаз [125, 167, 170, 201].

При одноэлектронном восстановлении молекулярного кислорода образуется супероксидный анион-радикал (О₂Щ опасный для мембран клеток (рис. 1).

+е +е +е +е О2 —— О2 —— Н2О2 —— ОН —— 2Н2О | +2Н+ +Н+ +Н+

НО2^

Рис. 1. Процесс образования активных форм кислорода [59].

Супероксидный анион-радикал, окруженный молекулами воды, не способен свободно перемещаться через клеточные мембраны, что отличает его от кислорода [19, 25].

Наиболее сильным окислителем, по сравнению с супероксидным анион-радикалом, является гидропероксидный радикал (НО₂^). Он возникает при протонировании О₂^- в условиях кислой среды или в результате соединения различных органических радикалов с пероксидом водорода. Г идропероксидный радикал легко проходит через биологические мембраны и свободно диффундирует между всеми компартментами клетки, реагируя с различными аминокислотами, например триптофаном, гистидином, и с полиненасыщенными жирными кислотами [108].

Наиболее же стабильным типом АФК является пероксид водорода, время жизни которого составляет около 1 мс. Он образуется при двухэлектронном восстановлении молекулы кислорода или в результате дисмутации супероксидного радикала. Процесс дисмутации супероксидного анион-радикала происходит чаще всего при участии супероксиддисмутазы или спонтанно [59]. Пероксид водорода может быть и продуктом пероксисомальных реакций фотодыхания [164]. Он хорошо растворим в билипидном слое, и, вследствие этого, способен свободно перемещаться через клеточные мембраны [226].

Последующее восстановление пероксида водорода может привести к образованию гидроксильного радикала ОН\ который является наиболее реакционноспособным из всех типов АФК. В отличие от пероксида водорода, гидроксильный радикал, быстро взаимодействуя с различными биомолекулами, свободно не переходит через мембраны клеток. Время жизни данного радикала составляет 10^-9с. Гидроксильный радикал, оказывая влияние на БН-группы, гистидиновые и другие аминокислотные остатки белков, вызывает их денатурацию и инактивирует ферменты.

1. Реакция Хабера-Вейсса (при физиологических условиях в растениях протекает медленно):

Н₂О₂ + ОГ ^ О₂ + Н₂О + ОН

2. Реакция Фентона - цикл реакций, включающий окисление ионов различных металлов, например железа или меди, имеющих переменную валентность:

Н2О2 + Fe²⁺(Cu⁺) ^ Бе³⁺(Си²⁺) + ОН^- + ОН Бе³⁺(Си²⁺) ^ Fe²+(Cu+) + О2

В тоже время, образование ОН возможно и при взаимодействии Н₂О₂ с ферридоксином, убихиноном, в процессе радиолиза воды [135].

К представителям АФК принадлежит и синглетный кислород, процессы образования которого связаны с реакциями фотосинтеза. Синглетный кислород является одним из реакционноактивных типов АФК, вызывает окисление белков, углеводов, липидов, фенолов, реагируя по двойной связи с образованием различных гидроперекисей [59, 67].

Образование АФК может быть связано не только с электроно­транспортными цепями хлоропластов и митохондрий, но и с работой целого ряда ферментов. Одним из таких ферментов, участвующих в образовании АФК, является НАДФН-оксидаза [24, 193]. Данный фермент локализован в основном в плазматической мембране клеток, катализирует образование супероксидного анион-радикала [210, 248, 253]. При его блокировании ингибируется процесс формирования различных типов АФК [240]. При этом показано, что индуктором экспрессии НАДФН-оксидазы может выступать пероксид водорода [76, 134]. Данный механизм активации фермента может быть связан с действием патогенов на растения, что вызывало возрастание содержания пероксида водорода и приводило к активации НАДФН-оксидазы [59]. Отмечено [24] повышение активности НАДФН-оксидазы под влиянием различных как биотических, так и абиотических факторов, связанных с потоками Cа²⁺, активными формами кислорода, азота и передачей информации на ядерный геном.

В образовании АФК может участвовать и фермент пероксидаза, локализованный в цитозоле и отдельных структурах клетки [59]. Отмечено, что пероксидазы, окисляя различные соединения (салициловую кислоту, моноамины и хитоолигосахариды) в присутствии пероксида водорода, образуют при этом радикалы, взаимодействие которых с кислородом приводит к образованию супероксида [194]. При работе пероксидаз, а также ди-, полиаминоксидаз и оксалатоксидаз возможно накопление в клетках пероксида водорода [170].

В образовании супероксидного анион-радикала при определенных условиях может участвовать фермент ксантиноксидаза, обнаруженный в апопласте и пероксисомах растений [210].

1.2. Липоксигеназы и их роль в образовании АФК в растениях

Липоксигеназы обнаружены в различных организмах, включая грибы, цианобактерии, водоросли и более 60 видах высших растений [213].

Растительные липоксигеназы (линолеат: кислород-оксидоредуктаза КФ 1.13.11.12) принадлежат к классу диоксигеназ. Липоксигеназы катализируют реакцию окисления полиненасыщенных высших жирных кислот с образованием гидропероксидных производных [2, 136, 201]. Субстратами растительных липоксигеназ являются свободные, реже связанные в фосфолипидах полиненасыщенные жирные кислоты, такие как линолевая и линоленовая. Присоединение атома кислорода происходит в С-9 или С-13 положении, в связи с этим липоксигеназы делят на две группы 9- липоксигеназы и 13-липоксигеназы [64]. С меньшей скоростью фермент окисляет сложные эфиры полиненасыщенных жирных кислот, в том числе глицериды и эфиры стеринов, полиненасыщенные спирты и алкилгалогениды [203].

Липоксигеназа является мономерным белком с молекулярной массой 94-104 кДа. Фермент содержит атом железа, выполняющий важную функцию при энзиматической реакции [71]. Кроме того, были обнаружены липоксигеназы, содержащие атом марганца (Mn-липоксигеназа) [222].

Липоксигеназа может иметь разную локализацию в клетках растений. Фермент обнаружен не только в цитоплазме, вакуолях [229], хлоропластах и липидных телах [166], но также показано присутствием липоксигеназы и в митохондриях растительных клеток [137]. Показано присутствие как минимум двух изоформ липоксигеназ или в матриксе, или во внутренней мембране митохондрий этиолированных стеблей гороха [137].

Отмечено наличие как растворимых, так и мембраносвязанных липоксигеназ [234]. В настоящее время известны аминокислотные последовательности более 60 растительных липоксигеназ, для некоторых из них получены трехмерные модели [93]. Одной из первых липоксигеназ, обнаруженных в растительных клетках, была липоксигеназа семян гороха. Высокая активность фермента обнаружена и в растениях сои [207].

Метаболизм полиненасыщенных жирных кислот с участием липоксигеназ и соответствующие реакции получили название

липоксигеназного пути [139]. Липоксигеназный каскад достаточно часто активируется при действии различных стрессовых факторов [257]. Первым ферментом, начинающим такой каскад реакций, является фосфолипаза А₂. Под действием данного фермента высвобождается большое количество полиненасыщенных жирных кислот, которые далее подвергаются окислению липоксигеназами до гидропероксидов. Гидропероксиды, выполняя роль Са²+- ионофоров, способствуют поступлению кальция в клетки. Кальций же с помощью комплекса с кальмодулином может дополнительно активировать фосфолипазу А₂, которая вызывает последующую деградацию липидов [104].

Клонирование многих липоксигеназ и других ключевых ферментов липоксигеназного пути, а также анализ обратимых генетических и метаболических реакций позволили исследователям сделать предположения о механизмах действия, множественных функциях и регуляции разными факторами [167]. Предполагают участие липоксигеназ в ряде физиологических процессов растений, таких как рост и развитие [150]. Фермент способен ускорять процесс созревания плодов, который сопровождается деградацией хлоропластов и митохондрий [90]. Кроме того, липоксигеназы активируются при прорастании и хранении семян, а также используются в качестве запасного белка во время вегетативного роста [229]. Показано, что в клетках мезофилла листьев сои накапливаются вегетативные липоксигеназы, индивидуальные изоформы которых играют роль не только активных ферментов, но и временных запасных белков [158]. Липоксигеназы участвуют в формировании биологических посредников (сигнальных молекул), которые осуществляют реакции перекисного окисления, играют роль в биосинтезе травматиновой, жасмоновой кислот, этилена [27, 131, 143, 202], а также играют важную роль в защите растений от различных стрессовых воздействий [50, 255].

Продукты липоксигеназного окисления играют как положительную, так и отрицательную роль в растениях [27]. Липоксигеназа может вносить вклад в процессы накопления гидропероксидов, одного из типов АФК [2, 105, 201]. С одной стороны гидроперексиды полиненасыщенных жирных кислот, синтезируемые различными высокоспециализированными формами липоксигеназ, являются субстратами 7 различных семейств ферментов. С другой стороны, они могут индуцировать процессы программированной гибели клеток [185]. Среди продуктов липоксигеназного окисления обнаружены антимикробные и антигрибные соединения, такие как альдегиды или дивинилэфиры и видоспецифичные смеси летучих веществ [105, 167].

Мало изучена роль данного фермента в условиях гипоксического стресса. Так, было показано [187], что в клетках листьев картофеля в условиях аноксии увеличивалась как активность липоксигеназы, так и содержание ее м-РНК.