ВВЕДЕНИЕ

Процессы образования АФК, являющихся продуктами неполного восстановления молекулярного кислорода до воды, исследуются в различных организмах на протяжении длительного времени [67]. Один из механизмов образования АФК может быть связан с работой ферментов, включая и липоксигеназу [28, 105]. Поставщиком АФК в клетках растений могут являться и митохондрии, однако механизмы их накопления в данных клеточных компартментах при гипоксическом стрессе практически не изучены. Накопление АФК может быть одним из ранних клеточных ответов растений на действие стрессовых факторов [96], включая и гипоксию [39]. Однако остаются дискуссионными многие вопросы, связанные с образованием АФК, ускорением процессов свободнорадикального окисления, изменением активности ферментов в растениях при действии гипоксического стресса. Образование АФК [140] и процессы пероксидации липидов [112] могут протекать в условиях гипо- и аноксии, но значительно возрастают при возвращении растений на воздух (условия реаэрации).

В тоже время, в других исследованиях [187] отмечено усиление процессов перекисного окисления липидов в условиях даже кратковременной (до суток) аноксии.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование влияния условий кратковременной гипоксии и среды высоких концентраций диоксида углерода на образование активных форм кислорода и активность антиоксидантной системы в клетках различных по устойчивости растений.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1. выявить влияние гипоксии на скорость свободнорадикального окисления и продукцию различных типов АФК (супероксидного анион- радикала, гидропероксида и пероксида водорода) у растений;

2. исследовать действие фитогормонов кинетина и эпибрассинолида на процессы образования АФК в растениях в условиях разных газовых сред;

3. изучить активность антиоксидантных ферментов, таких как супероксиддисмутаза, каталаза, аскорбатпероксидаза и общая пероксидаза в растениях в разные периоды действия газовых сред;

4. выяснить роль липоксигеназы в процессах накопления отдельных типов АФК в клетках растений в условиях гипоксического стресса;

5. изучить скорость образования АФК в митохондриях различных растений при действии кратковременной гипоксии;

6. определить активность ферментов липоксигеназы и супероксиддисмутазы в отдельных клеточных компартментах растений при действии гипоксии и СО₂ - среды.

Научная новизна. Впервые проведено исследование продукции различных типов АФК в клетках растений, различающихся по устойчивости к условиям кратковременной (3-24 часа) гипоксии и среды высоких концентраций СО₂. Исследована активность ферментов антиоксидантной системы, таких как супероксиддисмутазы, каталазы, общей пероксидазы, аскорбатпероксидазы. Отмечено, что активность данных антиоксидантных ферментов была значительно выше у более устойчивых растений, чем у неустойчивых. Показано, что обработка растений фитогормонами кинетином и эпибрассинолидом снижали интенсивность процессов свободнорадикального окисления и продукцию АФК в растениях при действии гипоксического стресса.

Отмечено, что высокие концентрации СО₂ значительно усиливали как накопление разных типов АФК, так и повышение активность антиоксидантных ферментов и липоксигеназы, в отличие от обычной гипоксии. Полученные данные подтверждают представление о том, что диоксид углерода можно отнести к группе сигнальных молекул, способных включать системы адаптации растений к условиям гипоксического стресса.

Практическая значимость. Отработаны методики по исследованию содержания различных типов АФК в тканях и отдельных клеточных компартментах растений с использованием методов биохемилюминесценции и спектрофотометрии. Используемые методики по изучению активности антиоксидантных ферментов могут применяться при оценке степени устойчивости растений к стрессовым факторам, включая и дефицит кислорода. Выявлена способность фитогормонов кинетина и эпибрассинолида тормозить интенсивность свободнорадикальных процессов и образование АФК в клетках растений, что позволяет рекомендовать их для использования в практике растениеводства с целью повышения устойчивости растений к действию гипоксического стресса. Результаты работы могут использоваться в учебном процессе в разных ВУЗах. Материалы исследований применяются при проведении занятий по дисциплинам «Молекулярные основы адаптации растений к стрессам», «Гормональная система растений и ее роль в адаптации к стрессам», «Современные достижения молекулярной биологии» в Воронежском государственном педагогическом университете на отделении «Биология» для бакалавров и магистров. Кроме того, они используются при выполнении выпускных квалификационных работ и магистерских диссертаций.

Положения, выносимые на защиту.

1. При действии гипоксического стресса у неустойчивых проростков гороха, в отличие от сои и кукурузы, повышается интенсивность процессов свободнорадикального окисления и генерации АФК, что сопровождается снижением активности антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, каталазы, аскорбатпероксидазы и общей пероксидазы).

2. Фитогормоны кинетин и эпибрассинолид снижают интенсивность свободнорадикального окисления и образование АФК в растениях в условия гипоксии и среды высоких концентраций диоксида углерода.

3. В митохондриях растений гороха и сои обнаружено присутствие молекулярной формы липоксигеназы, отличающейся по электрофоретической подвижности от цитоплазматической и хлоропластной форм. Липоксигеназа митохондрий вносит существенный вклад в процессы накопления АФК в клетках растений в первые часы действия гипоксического стресса.

4. В различных клеточных компартментах (митохондриях, хлоропластах и цитоплазме) растений в условиях дефицита кислорода происходит изменение как содержания АФК, так и активности антиоксидантного фермента СОД, что определяется степенью устойчивости растений к гипоксии.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международной научной конференции «Проблемы

биоэкологии и пути их решения» (Саранск, 2008), XII съезде русского ботанического общества (Петрозаводск, 2008), на 13, 15-17-ой Путинской школах конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009, 2011-2013), на всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009), на III, IV всероссийских конгрессах «Симбиоз - Россия» (Нижний Новгород, 2010; Воронеж, 2011), на всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010), на VII, VIII Съездах Общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011; Петрозаводск, 2015), на всероссийской научной конференции «Факторы устойчивости растений в экстремальных природных условиях и техногенной среде» (Иркутск, 2013), на 18, 19, 20 конгрессах FESPB (Spain, 2010; Germani, 2012; Ireland, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 работы, из которых 3 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы (264 источника) и приложения. Работа изложена на 170 страницах, включает 22 рисунка и 13 таблиц. В приложении содержатся 8 таблиц.

Работа выполнялась в рамках аналитической ведомственной целевой программы Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы» (2009-2011), а также госзадания Министерства образования и науки РФ (2012-2013), регистрационный номер 4.4698.2011.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ