2.2.4. Изучение условий поддержания и хранения культур М. pachydermatis в лабораторных условиях

В повседневной лабораторной практике часто возникает необходимость сохранения культур возбудителей, выделенных из патологического материала, для дальнейшего изучения. Известно, что липофильные дрожжевые грибы рода Malassezia очень прихотливы с точки зрения их культивирования in vitro [57].

Сохранность культур М. pachydermatis при различных режимах пересевов на питательных средах

Табл. 9 № штамма Наличие роста культуры п ри различных интервалах между пересевами 7 сут. 14 сут. 21 сут. 1 мес. 1,5 мес. 2 мес. 2,5 мес. С-а Б С-а Б С-а Б С-а Б С-а Б С-а Б С-а Б 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 12803 + + + + + + +,с + - +,С - - Н/о Н/о 15003 + + + + + + +,с + +,с +,С - +,с - - 15503 + + + + + + +,С + +,с +,С - - Н/о Н/о 16103 + + + + + + + + +,С + - +,С - - 16903 + + + + + + +,С + - +,с - - Н/о Н/о Наиболее доступным и распространенным методом поддержания культур грибов являются периодические пересевы на агаризованных средах, между которыми культуры хранятся в холодильнике при 5-8°С. Большинство дрожжевых грибов сохраняет жизнеспособность при 4-12°С и интервалах пересевов 6-8 мес. [172]. Однако, при работе с культурами М. pachydermatis мы (как и другие исследователи) столкнулись с тем, что при хранении они утрачивают жизнеспособность гораздо быстрее, нежели другие виды грибов. Таким образом, возникла необходимость в определении оптимального режима поддержания культур М. pachydermatis. Результаты определения сохранности культур М. pachydermatis при различных интервалах между пересевами представлены в табл. 9.

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 11903 + + +,с +,с - - Н/о Н/о Н/о Н/о Н/о Н/о Н/о Н/о 13703 + + + + + + +,с + +,с +,с - - Н/о Н/о Примечания: «с-а» — сусло-агар; «Б» — среда Барфатини; «+» — рост культуры в виде однородного газона; «+,с» — слабый рост культуры в виде обособленных колоний; «-» - рост культуры не наблюдается.

В работе было использовано 7 эпизоотических штаммов М.

Для длительного хранения предпочтительнее использовать среду Барфатини, обеспечивающую большую жизнеспособность М. pachydermatis. Вероятно, наличие в этой среде оливкового масла не только оптимально обеспечивает питательные потребности гриба, но и замедляет пересыхание среды. Для краткосрочного хранения (7-21 сут.) культур М. pachydermatis вполне пригоден сусло-агар.

Можно заключить, что при поддержании культур М. pachydermatis интервалы между пересевами не должны превышать 1 мес., а наиболее ценные штаммы целесообразно пересевать каждые 2 недели. Еще одним распространенным методом хранения культур грибов является криогенное хранение с использованием глицерина в качестве криопро-

тектора [57]. Нами была изучена жизнеспособность 7-ми штаммов М. pachydermatis при хранении под слоем глицерина при температуре -16 - -18°С. Установлено, что все штаммы оставались жизнеспособными в течение 3 месяцев (срок наблюдения).

Для длительного многолетнего хранения культур грибов широко применяется метод лиофильной сушки, однако сведения о его использовании применительно к грибам рода Malassezia ограничены [70, 57].

Эксперимент по лиофилизации культур М.

вместно с заведующим отдела, Ю.Г. Опариным

В эксперименте были использованы два штамма М. pachydermatis №№12803 и 15003, представляющие интерес для дальнейших научно- исследовательских работ. Для лиофилизации применялись 2 варианта защитной среды: 1) защитная среда №4 ВГНКИ (желатино-пептон-сахарозная); 2) молоко с инозитом (5%). Рецептура сред была предложена Ю.Г. Опариным на основании положительных результатов использования данных сред при лиофилизации культур грибов Candida albicans.

Замораживание биоматериала, сушка, вакуумирование и запайка ампул осуществлялись по стандартной технологии. До и после лиофилизации в культурах определяли концентрацию дрожжевых клеток (общую и жизнеспособных) и наличие посторонних микроорганизмов. В готовых ампулах определяли остаточную влажность и наличие вакуума. По окончании контроля ампулы с культурами М. pachydermatis были заложены на хранение при температуре 5-8°С. Общий срок хранения ампул составил 3,5 года. По окончании хранения в ампулах определяли концентрацию жизнеспособных дрожжевых клеток в сравнении с исходными показателями, изучали культу- ральные и морфологические свойства.

В процессе 3,5-летнего хранения в лиофилизированном состоянии произошло резкое снижение жизнеспособности у обоих штаммов М. pachyderma- tis. Концентрация жизнеспособных клеток составляла лишь 2,5-5,0% от общей концентрации дрожжевых клеток в ампулах, в то время как сразу после сушки этот показатель составлял 57-69%. Защитная среда №4 ВГНКИ обеспечивала несколько большую жизнеспособность гриба, нежели молоко с 5% инозитом. Культуральные и морфологические свойства штаммов за время хранения не претерпели видимых изменений.

Результаты изучения жизнеспособности культур М. pachydermatis при хранении в лиофилизированном состоянии представлены в табл. 10. Табл. 10 Изученные свойства Штамм №15003 Штамм № 12803 З.с. №4 ВГНКИ З.с. молоко- инозит З.с. №4

ВГНКИ З.с. молоко- инозит Общая концентрация клеток, млн/смЗ 1087,0 540,0 590,0 770,0 Исходная концентрация жизнеспособных клеток, млн/смЗ/% к общей 706,5/65,0 372,6 / 69,0 360,0/61,0 439,0 / 57,0 Концентрация жизнеспособных клеток после хранения, млн/смЗ/% к общей 55,0 / 5,0 12,5/2,3 15,0/2,5 19,0 / 2,4 Наличие вакуума в ампуле Есть вакуум Есть вакуум Есть вакуум Есть вакуум Наличие посторонних микроорганизмов отсутствуют Отсутствуют отсутствуют Отсутствуют Культуральные и морфологические свойства Типичные для М. pachydermatis Типичные для М. pachydermatis Типичные для М. pachydermatis Типичные для М. pachydermatis 41. Изменения свойств лиофилизированных культур М. pachydermatis при

хранении в течение 3,5 лет

Полученные результаты показали принципиальную возможность ис

пользования лиофильной сушки для длительного хранения культур М. pachydermatis, однако для обеспечения большей жизнеспособности, очевидно, необходима оптимизация условий лиофилизации.