КОЛОНИЗАЦИЯ РИЗОСФЕРЫ РАСТЕНИЙБАКТЕРИЯМИ-АНТАГОНИСТАМИ РОДОВPSEUDOMONAS И AZOTOBACTER

  Современные представления о функционировании микробных сообществ весьма ограничены и о реальных взаимодействиях микроорганизмов в природных местообитаниях известно крайне мало. Мнение о том, что привнесенная популяция погибает в нестерильной почве, что связано с антагонизмом по отношению к посторонней микробиоте со стороны почвенных микроорганизмов и выеданием ее простейшими, не оправдалось.

В настоящее время распространено представление о ненасыщенности комплекса почвенных микроорганизмов, т.е. о способности принять в себя внесенные извне популяции [Кожевин, 1985].
Показано, что в регуляции численности микробных популяций в почве основную роль играют не внутри-, а межпопуляционные процессы. Тип взаимодействия одной и той же пары популяций может меняться в ходе сукцессии. На выживание конкретного микроорганизма в почве оказывают влияние свойства почвы, количественный уровень внесения и стадия микробной сукцессии, на которой вносится популяция [Полянская, Звягинцев, 1984; Тригер и др., 1990].
При исследовании способности к размножению на семенах и корнях пшеницы антифунгально активных рифампицинустойчи- вых мутантов р. Pseudomonas установлено, что способность бактерий к размножению на корнях пшеницы штаммоспецифична. Как правило, лучше всего размножались на корнях пшеницы штаммы, выделенные из ризосферы пшеницы [Гарагуля и др., 1988].
Изучению пространственно-временного характера колонизации подземных органов картофеля антагонистической бактерией P.fluorescens посвящена работа J.B. Bahme и M.N. Schroth [1987]. Культуру бактерии P.fluorescens (штамм Al-В) вносили в почву с блоками из зерна, которые содержали по 108 КОЕ/блок. Штамм заселял корни, подземные части побегов, столоны и клубни, причем наибольшую плотность отмечали на частях растений вблизи блоков. Штамм не был приурочен к определенному участку корней: 41% клеток находились в ризосфере, 54% - неплотно прилегали к поверхности корней и 5% - находились в тесном контакте и даже проникали в корни.
Бактериальные сообщества трех мест обитания (ризосфера, внутренние ткани корней и почва) изучали для выявления количественных и качественных изменений, связанных с внедрением штамма Р. fluorescens PGPR 89-В-27 и его люминесцентного производного. Исследование популяций трех сред обитания показало, что они достоверно различались по видовому составу и количеству. Структура популяций в вариантах с двумя бактериальными обработками достоверно отличалась от неинокулированного контроля, но не отличалась одна от другой [Mahaffee et al., 1995].
Проведено сравнительное изучение поведения интродуциро- ванных бактерий в моноксеничных условиях (агар, песок) и в нестерильной почве. Количество клеток Р. fluorescens в зоне апекса в моноксеничных вариантах в 29,7 раз больше, чем в варианте с почвой. В моноксеничных вариантах и вариантах с почвой наибольшая плотность внесенной популяции наблюдалась в зоне основания и уменьшалась по направлению к апикальной части корня [Кравченко, Макарова, 1993].
Изучая процесс заселения флуоресцирующими псевдомона- дами-антагонистами фитопатогенных микроорганизмов корней растений, авторы не могли не отметить, что инокулирование семян бактериями способствовало защите растений от болезней [Caponlgro, Contillo, 1986], а также приводило к увеличению массы стеблей и корней [Munoz-Garcia, Valdes, 1995].
Колонизация корней сои бактериями Pseudomonas и Serratia spp. в связи с подвижностью, хемотаксисом и временем генерации исследована в работе [Scher et al., 1988]. Установлено, что при одинаковом среднем периоде генерации бактерий в жидкой питательной среде уровень колонизации корней и семян для разных штаммов был отличен. Показано также, что подвижность бактерий не являлась необходимой для успешной колонизации.
В работах других авторов [Wessendorf, Lingens, 1989; Zablotowicz et al., 1991] акцент сделан на изучение влияния почвенных условий, условий культивирования, исходной плотности бактериальной суспензии на выживание интродуцированных в почву штаммов. Показано, что максимальная колонизация корней сои и сурепицы штаммами Pseudomonas достигается при внесении в почву водной суспензии с титром 108 клеток/мл. При такой инокуляционной нагрузке колонизация корней сои, сурепицы и пшеницы превышала КИ-Ю5 клеток/г сырых корней, тогда как колонизация корней кукурузы составляла менее KP-IO4 клеток/г [Zablotowicz et al., 1991]. Внесенный на уровне 107 и 109 КОЕ/г штамм Р. fluorescens R1 сохранял плотность на 30-е сутки на уровне 1,3 • 104 КОЕ/г, а при внесении на уровне 105 КОЕ/г - полностью исчезал из посевов. Динамика снижения плотности R1 была сходной во всем диапазоне влажности почвы от 14 до 24%. Из песчаной почвы на 30-е сутки R1 не высевался, тогда как из глинистой выделялось 106 КОЕ/г [Wessendorf, Lingens, 1989].
Существует несколько методик наблюдения за развитием популяций бактерий в гетерогенной среде. Очевидно, что наиболее популярны методы, основанные на получении антибиотикоустойчивых штаммов. На примере следующей работы [Tang Weizhen et al., 1995] показано, что получаемые с помощью методов генетического маркирования мутанты нередко частично или полностью утрачивают полезные свойства материнского штамма.

При введении в штамм Р. putida GR12-2 многокопийной плазмиды pGSS15 (кодирует устойчивость к ампициллину и тетрациклину) наблюдали замедление роста (время клеточной генерации возрастало от 1,6 до 1,8 ч), снижение приживаемости в почве и способности стимулировать удлинение корней полевой капусты (Brassica campestris).
Показано, что внесение в почву экзотических источников углерода способствует увеличению в ризосфере растений численности популяции плазмидосодержащих вариантов PGPR р. Pseudomonas, способных к утилизации этих соединений. Так, численность популяции штамма Р. aureofaciens BS1393 (pBS216), содержащего плазмиду биодеградации нафталина, в присутствии салицилата натрия увеличивалась в 4 раза в почве и в 20 раз в ризосфере пшеницы по сравнению с исходным безплазмидным штаммом. Используя данный подход в случае бактерий, стимулирующих рост растений и защищающих их от фитопатогенов, можно существенно повысить эффективность использования биопрепаратов на их основе [Мордухова и др., 2000].
В микрополевом эксперименте проведена оценка динамики плотности колонизации корней ячменя генетически измененными по признаку фиксации азота ризобактериями Pseudomonas. Показано, что способность фиксировать азот определяет возрастание численности ризобактерий на поверхности корней в фазы колошения - молочной спелости [Бажанов и др., 1995].
Анализ данных литературы наглядно демонстрирует, что бактерии р. Pseudomonas, нанесенные на семена, способны успешно колонизировать ризосферу различных растений (пшеница, картофель, томаты, огурец, салат, соя, табак, гвоздика), поддерживая высокую численность (в среднем 103-105 КОЕ/г корней), выживать в почве и филлосфере. Несомненно, что это свойство псевдомонад имеет особое значение для осуществления штамма- ми-антагонистами биологического контроля в ризосфере растения-хозяина. К сожалению, в литературе недостаточно четко освещен вопрос о том, какое влияние оказывают интродуцирован- ные иггаммы-антагонисты р. Pseudomonas на аборигенную микрофлору растений, а также как влияют условия нового местообитания на сохранение антагонистических характеристик штаммов псевдомонад.
Прикорневая зона и корни вегетирующих растений - благоприятное место обитания многочисленных представителей почвенной биоты, поэтому для изучения выживания интродуциро- ванных штаммов-антагонистов на корнях растений необходимо пользоваться методами маркирования используемых штаммов. Одним из методов, позволяющих обнаруживать на корнях растений среди аборигенной микробиоты интродуцированные штаммы, служит метод генетического маркирования. Методы генетического маркирования основаны на использовании антибиотикоустойчивых штаммов. Их получение связано с отбором резистентных клонов на средах, содержащих повышенные концентрации антибиотиков. При получении антибиотикоустойчивой модификации исходного штамма необходимо удостовериться, что полученный мутант генетически стабилен в своей нечувствительности к высоким концентрациям антибиотика, а также не утратил важных свойств исходной бактериальной культуры.
Для получения антибиотикорезистентных клонов штаммов Р. aureofaciens ИБ 51 и Az.vinelandii ИБ 4 культуры выращивали в жидкой среде Кинг В либо среде 40 на качалке (п = 170 об/мин) при 26° в течение 24 ч. Накопительную культуру из колб высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей антибиотик стрептомицин для штамма Р. aureofaciens ИБ 51 либо ампициллин для штамма Az. vinelandii ИБ 4 в концентрации 100,200, 300, 400 и 500 мкг/мл. Засеянные чашки Петри выдерживали в термостате при температуре 28° в течение 3 сут.
Клоны спонтанных мутантов, полученные на среде, содержащей антибиотик в концентрации 500 мкг/мл, пересевали затем последовательно на среду МПА со стрептомицином в концентрации 600, 700, 800, 900, 1000 и 1500 мкг/мл. В итоге получили клоны псевдомонад, устойчивые к концентрации стрептомицина в среде 1000 мкг/мл, и клоны азотобактера, устойчивые к концентрации ампициллина в среде 1500 мкг/мл.
Полученные клоны прошли проверку их антагонистической активности к фитопатогенным грибам. Исходя из диаметра зон подавления роста тест-грибов на плотной среде, среди полученных клонов были отобраны наиболее активные антагонисты. Стабильность признака устойчивости к антибиотику была проверена путем проведения клонов через пять пассажей на среды без антибиотика с последующим высевом на среду со стрептомицином либо ампициллином. Для ампициллинрезистентного штамма Az. vinelandii ИБ 4ап|р также была проверена способность расти на среде, не содержащей азот, для чего была использована среда 40 без дрожжевого автолизата.
Среди клонов, обладающих устойчивостью к антибиотикам, для дальнейших исследований в вегетационных и полевых опытах отобрали стрептомицинустойчивый мутант Р. aureofaciens ИБ 51str, и ампициллинустойчивый мутант Az. vinelandii ИБ 4“"р.

Еще по теме КОЛОНИЗАЦИЯ РИЗОСФЕРЫ РАСТЕНИЙБАКТЕРИЯМИ-АНТАГОНИСТАМИ РОДОВPSEUDOMONAS И AZOTOBACTER:

1. Изучение влияния интродукцииштаммов-антагонистов родов Pseudomonas и Azotobacterна микробиоту ризосферы пшеницы
2. ВЫДЕЛЕНИЕ И ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАНОВЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙРОДОВ PSEUDOMONAS И AZOTOBACTER -АНТАГОНИСТОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ
3. БАКТЕРИИ РОДОВ PSEUDOMONAS И AZOTOBACTER -АНТАГОНИСТЫ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВИ БАКТЕРИЙ
4. МИКРООРГАНИЗМЫ РИЗОСФЕРЫ И РИЗОПЛАНЫ
5. Изучение способности к колонизации корней растенийу стрептомицинрезистентного штаммаPseudomonas aureofaciens ИБ 51 и ампициллинрезистентного штаммаAzotobacter vinelandii ИБ 4 P
6. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИОПЫТНО-ПРОМЫШЛЕННОГОПРОИЗВОДСТВАБИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ-АНТАГОНИСТОВ
7. о.н. логинов. БАКТЕРИИ Pseudomonasи Azotobacter как объектысельскохозяйственнойбиотехнологии, 2005
8. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКАИ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИТОВ,ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ,ПРОДУЦИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДОВ PSEUDOMONASИ AZOTOBACTER
9. Структура и свойства новых метаболитов Pseudomonas и Azotobacter,обладающих фунгицидной активностью
10. Особенности антагонистического действия  штаммов псевдомонад и азотобактерана фитопатогенные грибы