Почвенные животные

Методы исследования почвенных простейших. Наблюдения за почвенными простейшими можно проводить непосредственно на почвенных частицах, а также с помощью микроскопирования почвенной суспензии.

Приемы изучения простейших с использованием питательных сред. Для исследования почвенной микрофауны используют педоскопы (см. с. 228), капилляры которых заполняют 1‘%-ным агаром с питательными веществами, например, с органо-минеральными комплексами гумусовых веществ, свойственных изучаемому типу почвы. Модификация этих методов применительно к простейшим — проращивание почвенного мелкозема на покровных стеклах, покрытых тонким слоем водного раствора агара во влажных камерах. Этот метод дает возможность определить живых простейших, приготовить их препараты.

Наиболее широко при работе с почвенными простейшими используется метод культур на искусственных питательных средах. Среду выбирают в зависимости от характера простейших и их пищевых требований. Так, в жидкой среде развиваются в основном активно двигающиеся инфузории и жгутиконосцы, на плотных агаризованных средах — главным образом амебы. В случае использования бедных питательными веществами сред, лишенных избирательных свойств (почвенного экстракта, дистиллированной и водопроводной воды), в них развивается меньшее количество организмов, но видовой состав их более разнообразен.

Методы исследования отдельных групп почвенных простейших. Они имеют свои особенности. Для выделения и подсчета активно двигающихся инфузорий и жгутиконосцев используют метод предельных разведений навески почвы жидкой питательной средой (сенной отвар с почвенной вытяжкой в соотношении 1:1).

Микроскопический контроль за культурами и определение проводят с 3—4-х по 30-е сутки инкубации несколько раз, так как инцистиро- вание и эксцистирование разных видов происходит в разные сроки. Для замедления движения организмов используют настой айвовых семян или 0,001% агар.

Количество простейших определяют по таблице Мак Креди для подсчета микроорганизмов (табл. 3). Сначала составляют числовую характеристику из трех цифр: первая соответствует числу повторностей — обычно 3. При этом отмечают, в каком самом большом разведении впервые во всех трех пробирках появились простейшие. Следующие две цифры числовой характеристики соответствуют числу повторностей, в которых развилась культура в двух разведениях, следующих после отмеченного. В табл. 3 находят вероятное число, соответствующее полученной числовой характеристике. При пересчете количества простейших на 1 г почвы это число умножают на знаменатель того разведения, где впервые во всех 3-х повторностях появилась культура. При анализе влажной свежей почвы учитывают процент влажности.

Таблица 3

Определение количества простейших в 1 г почвы (3 повторности: по Мак-Креди с сокращениями)

Используют также метод подсчета простейших путем последовательного ряда десятичных разведений навески почвы стерильной водопроводной водой.

Для исследования голых амеб (Amoeboidea) наиболее часто применяют агаризованные среды. В качестве источника пищи для амеб используют культуры микроорганизмов — Escherichia coli или Azoto- bacter chroococcum.

Количество-амеб в 1 г почвы подсчитывают методом Сингха. Готовят 16 стерильных чашек Петри диаметром 10 см, в каждой находится восемь стеклянных колец высотой 10 мм и с внутренним диаметром 20 мм. В чашки разливают по 20—25 мл горячего стерильного агара (1,5% агар-агара, 5 г NaCl, 1 г СаСОз на 1 л воды) и распределяют кольца по краю чашки таким образом, чтобы они не соприкасались. После застывания агара в центр каждого кольца на агар наносят капельку густой суспензии бактерий Е. coli. Чашки ставят на сутки в термостат при температуре 37°. 10 г предварительно растертой почвы помещают в колбу с 50 мл стерильной водопроводной воды, несколько минут встряхивают, дают 30 с отстояться. Пипеткой берут 5 мл и переносят в пробирку с 5 мл стерильной воды и далее таким же образом до 15-го разведения. Из каждого разведения отдельной пипеткой вносят по одной капле суспензии на колонию Е. coli в каждое из восьми колец одной чашки Петри. Каждая чашка соответствует одному разведению в 8-ми повторностях; 16-я чашка только с Е. coli остается контрольной. Чашки помещают в термостат при 22—24° на 30 дней или содержат при комнатной температуре. Через 3—4 дня просматривают кольца для обнаружения активных простейших. Для этого стерильно микробиологической петлей делают соскоб с поверхности агара внутри кольца, добавляют каплю стерильной воды и препарат исследуют под микроскопом. Количество амеб определяют, подсчитывая кольца, в которых обнаружены простейшие в каждом разведении.

Для учета раковинных корненожек (Testacida) используют методику, предложенную М. С. Гиляровым. Взятую из свежего образца почвенную пробу объемом 0,5 см3 заливают раствором плазменного красителя виоламинблау в растворе фенола, разводят в 25 раз водой и делят на 5 порций. Взвесь рассматривают под микроскопом в чашке Петри с разделенным на квадраты дном и подсчитывают обнаруженных раковинных амеб, затем пересчитывают на исходный объем почвы.

Для учета раковинных корненожек можно использовать культуральные методы и методы прямого микроскопирования.

Культуральный метод заключается в том, что небольшой образец почвы или подстилки (1 г) добавляют к стерильной среде. Развитие культуры происходит в течение нескольких недель.

Прямые методы для учета раковинных корненожек — стекла по Джонсону и Моллисону и метод почвенных срезов. Метод Джонсона и Мол л исона дает возможность выявить пропорцию живых и мертвых клеток. Почвенный образец просеивают через сито с отверстиями в 2 мм и отвешивают необходимое количество почвы (подбирают так, чтобы обеспечить удобство пересчета на 1 г почвы и достаточную плотность организмов в поле зрения). Почву помещают в сосуд с 5 мл стерильной дистиллированной воды, тщательно размешивают и переливают в стерильную колбу на 100 мл. В первом сосуде остаются при этом грубые частицы песка. Взвесь затем разбавляют до 50 мл Н,5%-ным раствором агара, предварительно профильтрованным в горячем виде через бумажный фильтр. Колбу встряхивают и оставляют на 5 с для осаждения тяжелых частиц. Образец берут пипеткой непо

средственно под поверхностью суспензии, переносят на стекло счетной камеры, покрывают покровным стеклом и суспензия застывает. Затем счетную камеру погружают в стерильную дистиллированную воду, покровное стекло удаляют, лишний агар снимают скальпелем. При осторожном колебании стекла в воде пленка всплывает, ее помещают на обычное предметное стекло и медленно, чтобы избежать трещин, подсушивают при комнатной температуре.

Для выявления соотношения активных и инцистированных форм простейших одну из двух параллельных навесок почвы обрабатывают 2%-ной НС1 в течение нескольких часов. При этом активные формы погибают, цисты же сохраняют жизнеспособность. Их подсчитывают, применяя обычную методику. О количестве активных форм в почве судят по разности между подсчетами клеток в первой и второй навесках. Используют также нагревание почвенной суспензии до 60—70°.

Для цитологических наблюдений применяют прижизненное окрашивание клеток простейших водными растворами метиленового синего, метиленового зеленого, нейтрального красного и других красителей. Реснички, жгутики и пищеварительные вакуоли наблюдают в слабых разведениях туши. Фиксацию препаратов производят с помощью паров осмиевой кислоты или фиксатором Шаудина (насыщенный раствор сулемы — 2 г; спирт 96° — 1 г); фиксатор применяется нагретым до 50—60°. Ядро выявляют окрашиванием 0,1%-ным раствором метиленового зеленого в 1%-ной уксусной кислоте (фиксатор Роскина). Реснички и жгутики окрашивают иодом (несколько капель настойки иода в 10 мл воды). При добавлении 2—4% раствора соды рельефно выступает ресничный аппарат, строение рта и глотки. При исследовании раковинных амеб обращают внимание на раковинку, которую рассматривают в капле глицерина под микроскопом.

Методы исследования мелких почвенных членистоногих и нематод.

В лаборатории извлечение мелких членистоногих из проб проводят с помощью разных методов, поэтому образцы почвы завертывают в пергаментную бумагу или целлофан так, чтобы не нарушить сложение почвы в пробе, этикетируют, помещают в плохо проводящий тепло (деревянный) ящик с гнездами и транспортируют к месту анализа.

В лаборатории для учета микроартропод (клещей, коллембол, симфил) разделяют комочки почвы препаровальными иглами и непосредственно подсчитывают всех встреченных животных с бинокулярной лупой. Это крайне трудоемкий и поэтому редко применяемый метод.

Наиболее распространенными способами исследования численности почвенных микроартропод следует признать методы «автоматической выборки» членистоногих из почвенных проб. Эти методы носят название эклекторных методов, основанных на одной общей для всех обитателей почвы особенности — способности уходить вглубь при подсыхании верхних горизонтов почвы. Пробу почвы (5—1000 см3) помещают на сито, вставленное в воронку несколько большего диаметра. Под горлышко воронки подставляют сосуд с фиксирующей жидкостью — 70%-ным спиртом или 2%-ным формалином. При подсыхании пробы почвы, идущем интенсивнее сверху, мелкие членистоногие стараются уйти глубже. Переваливаясь сквозь ячейки сита, они попадают в сосуд с фиксирующей жидкостью, где их подсчитывают. Для ускорения подсушивания исследуемой почвенной пробы (или подстилки) применяют нагревание пробы лампой 40 Вт (нужно следить, чтобы температура поверхности почвы не поднималась выше 35— 40°). Способ предложен шведским энтомологом Тульгреном. Приборы, используемые в этом методе, — фото-термо-эклекторы — называются его именем:              воронки Тульгрена, эклекторы

Тульгрена (рис. 43).

Для экспедиционных условий удобны батареи эклекторов (рис. 44). Подсушивание образцов ускоряется либо током горячего воздуха, либо путем выставления эклекторов на солнечный свет.

В лабораторных условиях часто употребляют батареи эклекторов, в которых металлические воронки заменены четырехгранными воронками из плотного картона или бумаги. В этом случае подсушивание образца происходит за счет испарения.

Подготовка эклектора к работе состоит в следующем. Сито ставят на лист бумаги, помещают на его сетку пробу почвы, затем осторожно переставляют на другой лист бумаги, а просеявшиеся сквозь ячейки сита частицы почвы ссыпают с бумаги на пробу. После этого сито осторожно помещают в воронку и лишь затем подставляют под воронку сосуд с фиксирующей жидкостью. Фиксирующую жидкость с попавшими в нее животными фильтруют, фильтр расправляют на чашке Петри, подсчитывают число животных под бинокулярной лупой или под микроскопом. Для удобства подсчета фильтр еще до складывания следует разграфить на клетки простым карандашом.

Из других методов учета мелких почвенных животных известен

метод отмучивания в растворах поваренной соли с последующим центрифугированием. Количество отмучиваемых животных обычно больше, чем то, которое учитывается с помощью эклектора. Недостатки метода заключаются в том, что он выполняется в лаборатории, а не в поле, объем анализируемых проб невелик и метод неприменим к почвам с высоким содержанием органического вещества.

alt="" />

Рис. 44*. Походные установки с батареями эклекторов

Для учета нематод в почве применяют метод с «воронкой Бермана». Прибор состоит из воронки, вставленной носиком в пробирку. Воронка с пробиркой в свою очередь вставлена в сосуд, куда наливают воду так, чтобы воронка была почти доверху наполнена. В воронку на сите помещают пробу почвы (1 см3 или 1 г) так, чтобы она оказалась погруженной в воду. Лучше помещать на сито пробу почвы, не дожидаясь ее высыхания. Нематоды проползают через ячейки сита и попадают в пробирку. Подсчет нематод на дне пробирки проводят через сутки на часовом стекле или в специализированной камере.

Методы исследования крупных почвенных беспозвоночных. Методы учета почвообитающих или встречающихся в почве животных схематически можно разделить на прямые и косвенные.

Прямые методы позволяют исследователю получить цифры, соответствующие количеству учитываемых объектов либо на единицу площади поверхности почвы, либо на единицу объема почвы.

Косвенные методы учета позволяют сравнить с большей или меньшей степенью приближения заселенность разных участков, хотя и не дают точного представления о численности объекта учета. К косвенным методам учета относится, например, учет за плугом в отваливаемом слое и в борозде крупных заметных насекомых (проволочники,, личинки хрущей или дождевых червей). Метод подразумевает введение коэффициента пересчета, который определяется на основе сравнения с данными, полученными методом прямого счета. Применяется чаще всего в полевых и луговых условиях, но не в лесу или в горных местностях.

Подсчет личинок насекомых, концентрирующихся на приманках, также относится к числу косвенных методов. Так, проволочников улавливают на приманки из ломтей картофеля, натыкаемых на палочки и закапываемых в почву на глубину около 5 см на расстоянии 50— 100 см друг от друга. Для учета гусениц на полях пропашных культур- и на парах раскладывают кучки выполотых сорняков или скошенной травы, служащие приманками. Под каждой такой кучкой в местах с высокой плотностью залегания этих вредителей скапливается иногда по нескольку десятков особей. Проверку и подсчет гусениц проводят в ранние часы на следующее утро после раскладки.

Данные косвенных методов дополняют и уточняют данные, полученные другими методами, но не заменяют их. Методы прямого учета позволяют определить численность почвенных животных во всем заселенном ими объеме почвы (до глубины встречаемости), рассчитанную* на 1 м2.

Наиболее часто применяется метод послойной выгонки и разборки почвенных проб. Размер почвенной пробы зависит от степени увлажненности почвы: от 0,25 м2 во влажных районах до 1 м2 и даже до 2 м2 в сухих районах в сухие годы. В последнем случае беспозвоночные уходят на значительную глубину, а вырыть яму с отвесными стенками при малой площади пробы невозможно. Пробу берут вплоть до нижнего предела встречаемости почвенных животных. При достаточно высокой влажности — до глубины 30—50 см, в сухих местностях и особенно на легких почвах — до 100 см и более. При отборе пробы отмечают площадь, забивают по углам колышки, натягивают между ними бечевку. Затем от границ отмеренной площадки отгребают в разные стороны опад или подстилку (если проба берется в лесу) или сухую землю поверхностного слоя (на пару). Рядом с выбранной площадью помещают клеенку или плотную материю, на которую затем кладут почву. Сначала с площади пробы руками снимают опад и другие растительные остатки, которые тщательно вручную перебирают, учитывая и собирая всех найденных при этом животных, а траву выщипывают для того, чтобы облегчить разборку почвы из верхнего слоя. Встреченных на поверхности почвы животных учитывают отдельно от тех, что встречаются в толще почвы. После удаления разобранных растительных остатков приступают к выкапыванию почвы с площади пробы лопатой. Выбрасываемые на разложенную рядом с пробой клеенку небольшие порции почвы тщательно перетирают руками, разбивая крупные комки, разрывая дерновину. Всю почву из разбираемого слоя порцию за порцией перетирают на весу между ладонями, тщательно следя за ссыпающейся на клеенку почвой и собирая падающих животных.

Животных собирают отдельно из каждой пробы и слоя. Беспозвоночные, нуждающиеся в специальной сложной фиксации (дождевые черви, моллюски) или необходимые для принципиальных наблюдений, помещаются в матерчатые мешочки или банки с небольшим количеством взятой для пробы почвы. Хищники должны быть помещены поодиночке. Мелких насекомых, многоножек, мокриц для фиксации помещают в пробирки с 70%-ным спиртом с добавлением нескольких капель глицерина и формалина, крупных насекомых — в морилки или сосуды со спиртом. На сосуды прикрепляют этикетки, где числителем обозначается номер пробы, знаменателем — номер слоя с соответствующей записью в дневнике.

Удобнее всего при взятии проб анализировать почву слоями по 10 см вплоть до глубины встречаемости. С помощью метода ручной разборки учитывают дождевых червей, многоножек, насекомых и других крупных беспозвоночных. При отборе почвенных проб для учета крупных беспозвоночных иногда используют буры.

Для повышения точности размера пробы рекомендуется взятие проб с помощью забиваемых в почву рамок или пластинок. Способ пригоден только при отборе проб до глубины 20 см.

Метод промывки почв на системе сит применяют обычно в стационарных условиях, в помещениях с водопроводом. В полевых экспедиционных условиях метод промывки применяется в модификации Григорьевой. Образцы почв в мешках доставляют к берегу водоема, где проводят промывку на системе сит, изготовленных из чередующихся друг с другом цилиндрических ведер и ведер, расширяющихся кверху, днища которых заменены сеткой — наиболее крупноячеистой у верхнего, наиболее мелкой у нижнего ведра. Эффективность этого метода невелика при работе с лесными почвами, в которых обильны остатки растений, особенно на торфяниках.

Для учета дождевых червей в почве, кроме метода ручной разборки проб, используют также метод полива поверхности почвы раздражающими покровы червей жидкостями, заставляющими червей выходить на поверхность. Применяют 0,14—0,5% раствор формалина. Более слабые растворы используют на влажных почвах для выгонки таких червей, как Lumbricus terrestris, более крепкие — других видов червей.

Методы, используемые для учета крупных беспозвоночных, не всегда дают возможность количественно учесть всех представителей энхи- треид. Для учета этой группы применяют специальные методы. Метод Нильсена основан на принципе создания температурного градиента. Отдельные пробы помещают в цилиндрические сосуды (можно использовать консервные банки) диаметром около 20 см с дырчатым дном. На дно сосуда насыпают слой гравия высотой около 3 см, выше которого вставляют плотно пригнанное к стенке проволочное сито. На сито помещают пробу почвы, сверху присыпают ее влажным песком. Сосуды с пробами вставляют в нагреваемый на медленном огне сосуд с водой, налитой до высоты гравия в сосудах с пробами. Нагревают воду до 60—65° и выдерживают около 2 ч. За это время черви выползают из более горячего субстрата в песок, откуда их извлекают и подсчитывают.

Метод О’Коннора также предусматривает температурную выгонку. На носик большой воронки (диаметр около 10 см) надевают резиновую трубку с зажимом, под которую подставляют сосуд. В верхней части воронки укрепляют сито, на котором распределяют пробу почвы. В воронку наливают воду, чтобы почва оказалась погруженной в воду. Над пробой включают электрическую лампочку (60 Вт). При нагреве пробы энхитреиды мигрируют вниз и, проползая сквозь ячейки сита, тонут в воде, накапливаясь в носике воронки и в резиновой трубке. После 3 ч выгонки открывают зажим и черви со струйкой воды попадают в подставленный сосуд. Оба метода дают близкие величины при исследовании минеральных горизонтов почв. При выгонке из подстилки второй позволяет учесть в 1,5 раза больше энхитреид, чем первый.