4.9. Определение белкового азота

Принцип метода. Методы определения белкового азота включают выделение белка из обшей растительной массы. Для этого белок переводят в осадок, а небелковые азотистые соединения, хорошо растворимые в водных растворах, отмывают водой или слабым раствором осадите ля. Отмытый и подсушенный белок сжигают в концентрированной серной кислоте, при этом получаются следующие продукты окисления: Н20, С02, SOf~ из сульфгидрильных групп белка, a NH2 превращается в NH/, образуя растворимую соль, которая сохраняется в колбе. Полученный азот в виде аммиака отгоняют в аппарате Кьельдаля и результаты пересчитывают на белок.

Осаждение белка из раствора проводят одним из следующих реактивов: уксуснокислым свинцом (СН3СОО)2РЬ, медным купоросом CuS0j-5H20, натрием сульфосалициловым, трихлоруксусной кислотой, фосфориовольфрамовой кислотой и др.

В зависимости от осадителя различают и методы анализа. Метод Барнштейна основан на осаждении белков медным купоросом в щСлочной среде. Этот метод применяется как основной при экспертной оценке. Практика показывает, что по этому методу получаются несколько завышенные результаты, так как осаждаются не только белки, но и азот нуклеиновых кислот, азотистых оснований, алкалоидов. При массовых определениях используется менее трудоёмкий метод Плешкова, где осаждение белков проводят трихлоруксусной кислотой (ТХУ).

Определение белкового азота можно проводить в сыром и воздушио-сухом растительном материале. Для анализа семян берут навеску 0.2 - 0.3 г, а для вегетативных органов в воздушио-сухом состоянии - около 0.5 г.

Определение белкового азота с трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Процесс осаждения белкового азота можно ускорить, используя в качестве осадителя 50 %-ю трихлор-уксусную кислоту (СС1}СООН), при этом сильно снижается объём осадка. Метод широко применяется при массовых анализах. Ход анализа Навеску измельчённого растительного материала 3-5 г свежего или 0.3 - 0.5 г фиксированного материала переносят в стакан ёмкостью 150 мл, добавляют 25 мл дистиллированной воды, помешивая стеклянной палочкой с резиновым наконечником, нагревают до кипения и, не охлаждая раствора, прибавляют 5 мл 50 %- й трихлоруксусной кислоты, тщательно перемешивают.

Растительный материал с высоким содержанием крахмала нагревают на водяной бане при 40-50°С в течение 10 мин. Осаждённый белок оставляют иа 0.5 - 1 ч, затем фильтруют через беззольный рыхлый фильтр методом декантации, промывая осадок в стакане и на фильтре небольшими порциями 2 %-й трихлоруксусной кислоты. Общий объём промывного раствора » 200 мл. Осадок полностью переносят на фильтр. Отмытый белок на фильтре прямо с воронкой подсушивают в термостате при температуре 50-60°С примерно 1 час. Когда фильтр начнёт отставать от воронки, его осторожно сворачивают в трубочку и опускают на дно колбы Кьельдаля. Приливают, в зависимости от размера навески и величины фильтра, 10-20 мл конц. HjS04 цилиндром или автоматической пипеткой. Горло колбы закрывают стеклянной круглой пробкой которая предохраняет кислоту от выкипания. При этом за счёт процесса дегидратации под влиянием коиц. серной кислоты происходит "обугливание” фильтра и белкового остатка. Чёрная пористая масса в колбе постепенно разжижается при нафевании. Если этого не происходит, в колбу следует добавить ещё 5-7 мл концентрированной серной кислоты.

Колбу помещают на электроплитку или в специальный электронагреватель. Вначале процесс озоления ведут на слабом огне, используя регулировку печи реостатом или подкладывая под колбу асбест. Нельзя допускать, чтобы вспенивающаяся масса поднималась вверх по горлу колбы. Если на горле колбы оказались углистые частицы или возникло небольшое вспенивание, колбу охлаждают и смывают их осторожно каплями серой кислоты из пипетки. В колбу добавляют один из катализаторов после того, как раствор в колбе станет однородным. Озоление следует проводить при равномерном, но не бурном кипении серной кислоты, чтобы избежать потерь азота, периодически осторожно взбалтывая колбу. Сжигание ведут до тех пор, пока раствор в колбе совершенно не обесцветится. Обычно озоление органического вещества происходит за 3-8 ч в зависимости от вида материала, навески и интенсивности нагревания. Содержимое колбы Кьельдаля после окончания сжигания переносят количественно в отгонную колбу аппарата Кьельдаля и проводят отгон аммиака, см. стр. 59-61. Расчёт

Содержание белкового азота:

где: а - объём кислоты в приёмнике, мл ; н.к- нормальность кислоты, мг-экв, в - объём щёлочи, израсходованный на титрование, мл; н.щ- нормальность щёлочи, мг экв; 14 - атомная масса азота; Н - навеска,' г; 1000 - коэффициент пересчёта мг в г. Реактивы 50%-й раствор трихлоруксусной кислоты, 2 %-й раствор

ТХУ. Реактив Гроака, смешанный индикатор, при pH 5.5 - чёткое изменение фиолетового цвета на зелёный. Катализаторы:

а)              металлический порошок селена - 0.05 г;

б)              сернокислый калий, сернокислая медь и др.

4.10. Определение небелкового азота в водной вытяжке

Определение небелкового азота можно проводить двумя путями: расчётным и аналитическим. Расчётным методом небелковый азот находится по разности в содержании общего и белкового азота, выраженных в процентах. При аналитических работах возможны

следующие варианты: Прямое определение небелкового азота в водной вытяжке, которое обеспечивает наибольшую точность результатов. Этот метод используется в том случае, когда необходимо непосредственно определить содержание форм небелкового азота - аммиачную, нитратную и т.д. Определение его в фильтрационных водах после осаждения белка из навески медным купоросом по Барнцпейну; хлорной кислотой по Плешкову; уксуснокислым свинцом по Бертрану. Ход анализа На аналитических весах с помощью пробирки взять точную

навеску воздушно-сухого материала в пределах              1 ± 0.0001 г и

поместить в химический стакан объемом 150-200 мл. Если определение проводится из свежего растительного материала, берется навеска свежего растительного материала » 10 г, с одновременным определением влажности. Прилить цилиндром 125 мл дистиллированной воды, опустить в стакан палочку с резиновым наконечником. Нагреть водяную баню до 90°С, поставить в неё стаканы с испытуемым материалом и контрольный стакан с чистой водой (125 мл) и термометром. Экстрагирование азотистых веществ проводить в течение 30 мин при температуре в стаканах 80°С, часто помешивая палочкой. Охладить растворы до комнатной температуры в бане с холодной водой (сменить воду 2-3 раза). Для осаждения белков прилить к раствору градуированной пипеткой 0.5 мл 4 %-ного раствора уксусно-кислого свинца, хорошо размешать и дать отстояться образовавшемуся осадку несколько минут. Прибавлять реактив по 2-3 капли, каждый раз энергично взбалтывая палочкой, до полного осаждения белков. Если осаждение идёт мед ленно, оставить раствор на 1 час. Отфильтровать раствор через воронку диаметром 8-10 см со складчатым бумажным фильтром в мерную колбу на 200 мл, промыть стакан и осадок на фильтре 4-5 раз малыми порциями дистиллированной воды, довести до метки, перемешать. 50 мл раствора взять пипеткой и перенести в колбу Кьельдаля. Осторожно нагреть до кипения, упарить объём до 5-7 мл. Остаток раствора охладить, прилить 7 мл конц. Н?04, продолжить озоление раствора до бесцветного. В качестве катализатора добавить на кончике пера металлический селен или др. После окончания озоления раствор количественно перенести в мерную колбу на 200 мл и провести определение аммиачного азота по Несслеру или использовать отгои по микро кьельдалю.