МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА  

Определение глюкозы в крови, моче по цветной реакции с ор- то-толуидином. Принцип. Глюкоза при нагревании с орто-то- луидином в растворе уксусной кислоты дает окрашенное соединение, интенсивность окрашивания которого пропорциональна концентрации глюкозы. Анализ проводят не позднее 24—48 ч.

Реактивы: орто-толуидин (CH3C6H4NH2, ч.), обязательно подлежит перегонке в колбе-реторте при температуре 200 °С (на песочной бане). Свежеприготовленный орто-толуидин должен быть бесцветным или слабо-желтого цвета. Экстинкция при 590—655 нм против воды не должна превышать 0,02. Реактив стоек при хранении в посуде темного стекла без доступа воздуха; ледяная уксусная кислота (х. ч.);

20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; тиомочевина (ч. д. а.);

0,2%-ный раствор бензойной кислоты. 0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в 99,8 мл дистиллированной воды. Для более быстрого растворения нагревают на водяной бане;

орто-толуидиновый реактив. В 94 мл ледяной уксусной кислоты растворяют 0,15 г тиомочевины и добавляют 6 мл орто-толуидина. Реактив стоек при хранении в холодильнике;

калибровочный раствор глюкозы для ее определения в крови жвачных животных 500 мг/л (2,777 ммоль/л) и у моногастричных животных 1000 мг/л (5,555 ммоль/л). 500 мг или 1000 мг глюкозы, высушенной до постоянной массы, растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 мл в 0,2%-ном растворе бензойной кислоты или в воде. Экстинкция калибровочного раствора не должна давать резких колебаний, в противном случае необходимо готовить новый раствор.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; колба-реторта; песочная баня; водяная баня; термос на 3—5 л; пробирки центрифужные.

Ход определения. Подготовка безбелкового фильтрата крови. В центрифужную пробирку вносят 5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, 5 мл цельной крови и перемешивают. Готовят все на месте в момент взятия крови у животных. Пробирки помещают в термос со лвдом, доставляют в лабораторию, где пробирки помещают в центрифугу на 20—30 мин при 3000 мин-1. Верхний слой (безбелковый фильтрат) сливают в другую пробирку и в нем определяют глюкозу. (Можно, кроме того, определять неорганический фосфор и магний.) Хранят безбелковый фильтрат крови в холодильнике не более 5 дней.

Проведение анализа. В пробирку вносят 0,2 мл безбелкового фильтрата крови, 0,3 мл дистиллированной воды и 4,5 мл орто-то- луидинового реактива. Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 8 мин (точно). Вода должна непременно кипеть. После чего сразу охлаждают до комнатной температуры под водопроводной водой. Фотометрируют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 10 мм против контроля при длине волны 580—650 нм (оранжевый или красный светофильтр).

Контроль. 0,4 мл 20%-ной трихлоруксусной кислоты, 0,6 мл дистиллированной воды, 9,0 мл орто-толуидинового реактива (на две кюветы). Параллельно готовят калибровочную пробу.

Калибровочную пробу ставят так же, как опытную, но вместо безбелкового фильтрата крови берут 0,1 мл раствора глюкозы с концентрацией 50 или 100 мг%, 0,1 мл 20 %-ного раствора ТХУ, 0,3 мл дистиллированной воды и 4,5 мл орто-толуидинового реактива.

Расчет ведут по формуле

Соп = §2 • 50 (или 100),

к

где Соп — концентрация глюкозы в пробе, мг%; Еоп — оптическая плотность пробы; Ек — оптическая плотность калибровочного раствора; 50 (или 100) — коэффициент для пересчета в мг% (калибровочный раствор содержит 50 или 100 мг% глюкозы).

Для выражения глюкозы в ммоль/л коэффициентом при 50 мг%-ном растворе будет 2,777, а при 100 мг%-ном — 5,555.

Определение глюкозы в моче. После проведения качественной пробы на содержание глюкозы в моче в зависимости от характера реакции разводят мочу в 2—10 раз. 0,1 мл разведенной мочи смешивают с 4,5 мл орто-толуидинового реактива и далее обрабатывают и измеряют, как указано для крови. При расчете результатов соответственно надо учитывать разведение мочи.

Примечания. 1. Построение калибровочного графика не рекомендуется, так как интенсивность окраски проб зависит от условий опыта. Поэтому правильнее обрабатывать калибровочные пробы одновременно с опытными и вести расчет по приведенной выше формуле. 2. При исследовании крови свиней и лошадей целесообразно готовить стандартный раствор с содержанием 100 мг% глюкозы. В этом случае коэффициент для пересчета будет не 50, а 100. 3. Для снижения скорости гликолиза целесообразно кроме антикоагулянта добавлять фтористый натрий в количестве 2,5 мг/мл. В этом случае осаждение крови ТХУ не требуется и для анализа берут 0,1 мл стабилизированной цельной крови.

Источник: 52.

Изложенный метод определения глюкозы в биологических жидкостях по цветной реакции с орто-толуидином положен в основу наборов реактивов, реализуемых различными фирмами. В частности, в состав набора реактивов фирмы ЧНПТ «Филист диагностика» (Украина, Днепропетровск) входит раствор трихлор- уксусной кислоты (30 %); орто-толуидиновый реактив (орто-толу- идин, тиомочевина, уксусная кислота); калибровочный раствор глюкозы (5000 мг/л, 27,75 ммоль/л). К наборам заводского приготовления прилагаются соответствующие инструкции.