ИССЛЕДОВАНИЕ АЗОТНОГО ПИТАНИЯ И ОБМЕНА У РАСТЕНИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИЗОТОПА N15 [29]

Изучение процесса переработки минерального азота в растениях на белки всегда было одной из центральных проблем агрономической и биологической химии. Но до недавнего времени многие из наших представлений в этой области основывались скорее на гипотезах, чем на фактах, добытых в результате точного эксперимента.

что нельзя было строго разграничить вновь поступивший в растение азот или вновь синтезированные его соединения (аминокислоты, белки) от таких же, уже имеющихся в растениях соединений азота. Это исключало возможность проведения точного учета всех тех изменений, которые претерпевает минеральный азот на пути от поступления из почвы через корни растений до его локализации в белке листьев или семян.

Применение меченых атомов в биологии, приведшее к столь большим успехам в научной разработке ряда важнейших вопросов, оказывает неоценимую услугу и в исследованиях азотного обмена и азотного питания растений. Применяя в качестве источника азота для растений сульфат аммония, аммиачную селитру и любые другие соединения азота, обогащенные изотопом N15, и определяя затем содержание изотопа N15 в выделенных из растения соединениях азота, можно совершенно однозначно ответить на вопрос о том, как быстро поступает азот в тот или иной орган растения, с какой скоростью и в каких органах и тканях растений образуются интересующие нас азотистые органические соединения и какова их дальнейшая судьба в растениях. При этом весьма важным является то обстоятельство, что изотоп азота N15 по своему действию на живой организм в любой концентрации ничем не отличается от обычного азота. При использовании наиболее обогащенных изотопом N15 аммонийных или азотнокислых солей они будут оказывать на растения в точности такое же действие, как и обычные аммонийные или азотнокислые соли. Никакого токсического или, наоборот, стимулирующего влияния на растения и на животных изотоп N15 не оказывает.

В настоящей работе изложены основные результаты наших исследований по азотному питанию и обмену растений, проведенных за последние два года, с применением изотопа N15. Растения для этих исследований выращивались в условиях вегетационного павильона в торфо-песчаных или водных культурах. Питательная смесь, вносившаяся перед посевом растений, включала азот, обычно в дозе 0,3 г N на сосуд, в виде обыкновенного сульфата аммония и все остальные макро- и микроэлементы в нормальных их дозах. Когда растения достигали соответствующего возраста, им давалась азотная подкормка в виде сульфата аммония, обогащенного изотопом N15. Степень обогащения азота изотопом N15 во вносимом в подкормку сульфате аммония изменялась для отдельных опытов в широком интервале от 3-кратной до 40-кратной. В связи с -тем что к моменту внесения азотной подкормки, меченной по N15, в сосудах оставался в том или ином количестве не использованный растениями обычный азот (вносившийся до посева), фактическое обогащение азота изотопом N15 в питательной смеси в сосуде колебалось для отдельных опытов от 2—

4. кратного до 25-кратного. Через определенные промежутки

   времени после внесения меченой азотной подкормки растения снимались и шли в анализ. Для каждого опыта, как правило, устанавливалось несколько сроков уборки (не менее шести), с тем чтобы иметь более или менее полную кривую превращения азота в растениях во времени. Продолжительность экспозиции растений на меченой азотной подкормке изменялась в отдельных опытах от 15 минут до 240 часов. Одновременно с опытными растениями производилась уборка и контрольных растений, которым не давалась азотная подкормка. Сопоставляя данные анализа контрольных растений с результатами анализа опытных растений, можно было судить о количественных изменениях в содержании в растениях исследуемой фракции азота, вызванных внесением меченой азотной подкормки, что во многих случаях совершенно необходимо для правильной интерпретации данных изотопного анализа.

В убранных растениях определялся неорганический азот (аммиачный N), азот органических небелковых соединений,, представленный в опытных растениях в основном аминокислотами, азот хлорофилла, азот коллоиднорастворимых белков и азот нерастворимых тканевых белков.

Выполненные в нашей лаборатории анализы В. М. Макаревич показали, что запасные белки всех исследованных растений совершенно не содержат пролина и что они значительно богаче триптофаном, аланином, валином и лейцином, чем конституционные белки.

Выделенные из растений фракции азота сжигались по Кьельдалю и после отгона и улавливания аммиака переводились на вакуумной установке в элементарный азот, который затем поступал в изотопный анализ на масс-спектрометре. Измерение на масс-спектрометре дает степень обогащения исследуемой пробы азота изотопом N15. По экспериментально найденной величине обогащения изотопом N15 вычислялась степень обновления азота исследуемой фракции согласно формуле:

N = -^=j-100,

где N — обновленный N в процентах, А — обогащение изотопом N15 исходного источника азота; Ai — обогащение изотопом N15 исследуемого ^соединения азота; за единицу (1) принято* содержание изотопа N15 в обычном азоте (0,39%).

При вычислении степени обновления аминокислот и амидов (небелкового органического азота) в качестве исходного источника азота принимался вносимый в подкормку меченый сульфат аммония, аммиачный азот которого непосредственно используется на синтез аминокислот и амидов. Но на построение белка и хлорофилла идет не аммиак как таковой, а синтезированные за его счет аминокислоты. Следовательно, при вычислении и степени обновления азота белка и хлорофилла в качестве исходной величины (А) нужно принимать степень обогащения изотопом N15 азота аминокислот, являющихся непосредственными предшественниками белка в процессе его образования в растениях.

Таблица 1

Урожай зеленой массы овса и содержание в нем азота отдельных фракций в различные сроки после внесения подкормки с меченым азотом, 1953 г.

Подкормка растений меченым азотом в этом опыте производилась через 24 дня после появления всходов.

Результаты изотопного анализа отдельных фракций азота, выделенных из зеленой массы молодых растений овса, 1953 г.

Содержание в растениях небелкового органического азота {свободных аминокислот) непрерывно возрастает по мере удлинения экспозиции на меченом азоте.

Содержание азота конституционных и запасных белков при экспозициях на меченом азоте от 6 до 72 часов хотя в общем и повышается по мере удлинения экспозиции, но в очень слабой степени. Значительное увеличение содержания в растениях белкового азота наступило только при более длительных экспозициях— при 120 и 240 часов.

Увеличение содержания хлорофилла в растениях также стало достаточно заметным только при более длительных экспозициях (120 и 240 часов).

Однако из данных, помещенных в таблице 2, следует, что внесенный в подкормку меченый азот уже через 12 часов был обнаружен в белковых фракциях и в хлорофилле, а в последующие сроки содержание изотопа N15 в белках и в хлорофилле непрерывно возрастает, и через 72—120 часов степень обогащения изотопом N15 белков и хлорофилла практически становится равной степени обогащения изотопа N15 небелкового органического азота. Таким образом, несмотря на то что общее количество белка и хлорофилла в растении в течение 72 часов после внесения меченой азотной подкормки слабо изменялось, азотный состав этих веществ растений в те же сроки подвергался весьма интенсивному'обновлению.

Как следует из приведенных в таблице 2 данных, азот конституционных белков и хлорофилла в течение 72 часов обновлялся на 90—95%, а через 120 часов в растениях этого опыта произошло практически полное обновление азота белка и хлорофилла.

Обновление азотистого состава белка и хлорофилла может быть обусловлено двумя одновременно протекающими в растении процессами — новым синтезом белка и хлорофилла, в результате которого происходит наращивание массы этих веществ, и процессом самообновления белка и пиррольного ядра хлорофилла. В последнем случае происходит полный или частичный распад этих веществ с последующим ресинтезом их за счет аминокислот из обменного фонда растений. Из данных химического анализа растений следует, что в первые 72 часа после внесения меченой азотной подкормки содержание хлорофилла в растениях практически почти не изменялось, поэтому происшедшее в эти сроки обновление азотистого состава пиррольного ядра хлорофилла можно полностью отнести за счет непрерывного процесса его самообновления.

Таблица 3

Азот белка, синтезированного растениями во время их экспозиций

на N15 (опыт с овсом 1953 г.)

В таблице 3 приведена вычисленная по данным химического анализа степень обновления азотистого состава конституционных и запасных белков, обусловленная новым их синтезом, во время экспозиции растения на N15. Из сопоставления этих данных с фактическим обновлением азотистого состава белков, установленным изотопным анализом, следует, что обновление белка, происшедшее в первые часы экспозиции растений на меченом азоте, только в незначительной степени может быть обусловлено новым его синтезом за счет вносимого- в подкормку меченого азота. При более длительной экспозиции количество вновь синтезированного белка заметно возрастает и соответственно возрастает его роль в обновлении азотистого состава всей массы белка.

Таким образом, из результатов этого опыта вытекает, что в растениях, помимо нового синтеза белка и хлорофилла, про-

исходит непрерывно процесс самообновления этих веществ. Этот процесс протекает в молодых растениях с исключительно высокой интенсивностью. В данном опыте в течение 48-часовой экспозиции растений на меченом азоте обновилось около 60% азота конституционных белков и хлорофилла, ‘ хотя абсолютное содержание белка и хлорофилла в растениях в пределах этого срока изменялось в весьма незначительной степени.

При более длительных экспозициях растений— 120 и 240 часов экспериментально найденное обогащение изотопом N15 всех выделенных из растений фракций азота (небелковый органический азот,' белковый азот и азот хлорофилла) выражается одинаковой величиной, что является доказательством полного обновления азотистого состава белка и хлорофилла, происшедшего за это время.

Из результатов этого опыта также следует, что скорость обновления двух групп выделенных нами из растений белковых веществ — конституционных и запасных белков — весьма различна. Конституционные белки обновляются со значительно большей интенсивностью, чем запасные. В других опытах, с более короткими экспозициями растений на N15, меченый азот мог быть обнаружен в конституционных белках в более ранние сроки, чем в запасных белках. Это дает известное основание предполагать, что вначале синтезируются конституционные белки, которые, претерпевая соответствующие изменения, превращаются в более подвижные запасные белки.

Таблица 4

Содержание отдельных форм азота в растениях при различной экспозиции на N15 (опыт с озимой рожью)

В опыте с озимой рожью, прозеденном в августе 19-53 г., изучался азотный обмен корней и надземной зеленой массы ра-

стбний. Подкормка растений меченым азотом производилась через 25 дней после появления всходов.

.Для подкормки применялся сульфат аммония с 5-кратным обогащением изотопом N15 в дозе 0,24 г на сосуд. Опыт проводился в условиях водных культур.

В таблицах 4 и 5 приводятся урожайные данные и результаты химического анализа зеленой массы и корней растений.

Таблица 5

Содержание отдельных форм азота в корнях при различной экспозиции растений на N15 (опыт с озимой рожью)

Данные химического анализа зеленой массы !ржи (табл. 4) примерно однотипны с соответствующими данными, полученными в опыте с овсом в 1953 г. В первые 'часы экспозиции растений на меченом азоте содержание в зеленой массе обеих белковых фракций практически оставалось4 на одном и том же уровне, и только при 36-часовой экспозиции произошло достаточно заметное увеличение содержания белкового азота. Закономерных изменений в содержании хлорофилла за все время экспозиции растений на N15 не происходило.

Небелковый органический азот в первые восемь часов экспозиции оставался без изменения. В последующие часы экспозиции содержание небелкового азота иецрерывно возрастало, и к концу опыта оно увеличилось более чем в 2 раза против исходного состояния растений.

Несколько отличные результаты получены при анализе корней ржи (табл. 5). Здесь содержание конституционных белков практически оставалось без изменений за все 72 часа опыта. Зато количество запасных белков в корнях, начиная с 4-часовой экспозиции, быстро возрастало, и уже через 24 часа после внесения меченой азотной подкормки содержание азота запасных белков удвоилось против исходного состояния.

В таблицах 6 и 7 приводятся результаты изотопного анализа отдельных фракций азота, выделенных из зеленой массы (табл. 6) и корней (табл. 7) растений.

Результаты изотопного анализа отдельных фракций азота, выделенных из зеленой массы озимой ржи, 1953 г.

Таблица 7

Результаты изотопного анализа отдельных фракций азота, выделенных из корней озимой ржи, 1953 г.

Данные изотопного анализа показывают, что образование небелкового органического азота в корнях растений за счет переработки внесенного в подкормку меченого азота сульфата ам!мшия происходит в достаточно значительных масштабах уже в первые два часа опыта; в течение этого времени небелковый органический азот в корнях ржи обновился на 14,8%. В последующие часы опыта обновление этой фракции азота резко воз- растало, что полностью соответствует и данным химического анализа. Необходимо отметить, что в других опытах, проведенных при более кратковременных экспозициях, новое образование аминокислот в корнях растений было обнаружено даже через 15 минут после внесения азотной подкормки. Образование новых: аминокислот (небелкового органического • азота) в зеленой

7 Ф. В. Турчин

массе молодых растений озимой ржи начинается через 4 часа после внесения меченой азотной подкормки. В промежутке времени между 4 и 36 часами интенсивность синтеза аминокислот за счет внесенного в подкормку меченого азота резко возрастала, что обусловлено соответственным усилением поступления азота из корней в надземные органы растений.

Меченый азот в конституционных и запасных белках корней был обнаружен уже при 2-часовой экспозиции растений на N15, что указывает на исключительно высокую скорость вовлечения внесенного источника азота в белковые молекулы корней растений. В конституционных белках зеленых листьев меченый азот был обнаружен через 8 часов после внесения меченой азотной подкормки. Таким образом, в условиях этого опыта весь путь превращений азота в растении, начиная от поступления его из почвы и кончая включением его в состав белковой молекулы листьев растений, был пройден в течение 8 часов. Как видно из данных изотопного анализа, в зеленой массе ржи происходило непрерывное обновление азотистого состава белка и хлорофилла. Масштаб этого процесса в несколько раз превосходил интенсивность новообразования белка и хлорофилла (новообразования, приводящего к увеличению общей массы белка и хлорофилла в растении). Поэтому с достаточным основанием можно считать, что обновление белка и хлорофилла в этом опыте, так же как и в рассмотренном выше опыте с овсом, в основном обусловлено самопроизвольным частичным или полным распадом молекулы белка или пирролыного ядра хлорофилла с одновременно протекающим шроцесоом их воссоздания. В корнях ржи интенсивность обновления белка значительно ниже, чем в зеленой массе, что указывает на существенное различие в белковом обмене корней и зеленых частей растений. Но особенно интересные данные в этом опыте получены для запасных белков корней. Из приведенных в таблице 5 данных химического анализа следует, что содержание азота запасных белков в корнях интенсивно возрастает по мере удлинения экспозиции растений на меченой азотной подкормке. В то же время обновление азота этой фракции белка, вычисленное по данным изотопного анализа, начиная с первых двух часов экспозиции и до конца опыта, характеризуется сравнителыно малой величиной.

По данным химического анализа можно вычислить процент долевого участия вновь синтезированного белка в общей массе всего белка. Это будет показателем его обновления, обусловленного только возрастанием общей массы белка.

Сопоставление вычисленных таким путем данных с обновлением 'азота запасных белков, установленного по данным изотопного анализа, дает следующую картину (табл. 8).

Таким образом, обновление азота запасных белков корней, установленное по данным изотопного анализа, во все часы экспозиции растений было значительно ниже, чем оно должно было

Изменение в содержании в корнях ржи азота запасных белков и в степени его обновления при различной экспозиции растений на N15 по данным химического и изотопного анализа

быть, если (Судить только по приросту маосы белка, не принимая даже в расчет постоянно протекающего процесса самообновления белка. Особенно значителен разрыв между данными изотопного и химического анализа для экспозиций от 4 до 48 часов. Такого несоответствия между количеством запасного белка, образовавшегося при экспозиции растений :на меченом азоте, и степенью обогащения этого белка изотопом N15 не могло быть, если бы вновь образовавшийся запасной белок был построен за счет внесенного в подкормку меченого азота. Сравнительно низкая -степень обогащения изотопом N15 запасного белка корней наряду с резким увеличением его общего содержания, происшедшим после внесения метеной азотной подкормки, может быть объяснена только в том случае, если допустить экзогенное «некорневое» образование большей части запасного белка, оказавшегося в корнях после внесения меченой азотной подкормки. Таким образом, мы можем сделать только один вывод, что содержание запасных белков в корнях при внесении азотной подкормки, увеличивалось в результате притока мобильных запасных белков из надземных органов растений, в данном случае из зеленой массы ржи. Так как внесенный в подкормку меченый азот включался в состав запасных белков зеленой массы ржи позже, то понятно, что приток запасных белков из зеленой маосы в корни вызвал соответственное понижение степени обогащения изотопом N15 общей массы запасных белков в корнях. Можно сделать предположение, что переработка в корнях растений неорганического азота в аминокислоты осуществляется при участии запасных белков, которые могут являться носителями соответствующих ферментных систем, катализирующих реакции синтеза аминокислот в растениях. При повышенном притоке неорганического азота содержание этих белков в корнях оказывается недостаточным и растения реагируют на это оттоком со- ответствующих количеств мобильных запасных белков из

листьев в корни. В пользу такого предположения отчасти говорят и данные, полученные в одном да наших опытов по изучению синтеза аминокислот в корнях при внесении азотной подкормки в 'виде аммиачного азота.

В первые часы после внесения азотной подкормки содержание непереработанного аммиака в корнях возрастало, но затем, после 12-часовой экспозиции растений на питательной смеси с аммиачным азотом, оно постепенно падало при одновременном возрастании интенсивности синтеза аминокислот, а через 72 часа после внесения азотной (подкормки в корнях овса можно было обнаружить только следы аммиака (табл. 9).

Таблица 9

Содержание аммиачного азота и азота некоторых аминокислот в корнях, мг N на 100 г сырого веса корней. Водные культуры

Очевидно, в первые часы после подкормки корни растений не были адаптированы для переработки больших количеств аммиака, но в дальнейшем, в результате регулирующих функций живого организма, поступивший в. корни аммиак полностью перерабатывался в аминокислоты и амиды. Возможно, что в этом приспособлении растений к переработке аммиака играет значительную роль перемещение некоторого количества запасных белков из листьев в корни растений.

В опыте, проведенном в 1954 г. с овсом, изучалась сравнительная скорость синтеза и обновления азота аминокислот (органического небелкового азота), конституционных и запасных белков и хлорофилла. Для этою опыт одновременно проводился в двух сериях: 1) в условиях обычного нормального освещения и 2) в условиях сильного затемнения. Затемнение опытных растений во второй серии производилось путем оплошного ограждения вагонеток с установленными на них сосудами черной хлопчатобумажной тканью. Опыт проводился в водных культурах. В качестве меченого источника азота для подкормки растений применялся сульфат аммония с 40-кратным обогащением изотопом N15. Столь высокое обогащение исходного источника азота позволяло весьма точно определить содержание меченого азота в выделенных из растений фракциях, даже в тех случаях, когда меченый азот включается в состав исследуемой фракции

в весьма незначительных количествах, 'что, как правило, имеет место при кратковременных экспозициях растений на меченом азоте. Как и lt;в других рассмотренных в этой статье опытах, подкормка растений меченым азотом производилась в ранние стадии развития растений, когда они достигали 25-дневного возраста. Проведение этих опытов представляло интерес с точки зрения установления непосредственной авязи между процессами фотосинтеза и образования белка и аминокислот в зеленых органах растений, на что имеются указания в ряде работ, проводившихся в последние годы как у нас, так и за рубежом [1, 2,

5. 6, 7].

В таблице 10 приведены урожайные данные и данные химического анализа растений для обеих серий опыта.

T а б л и ц а 10

Содержание в растениях (овес) отдельных форм азота при различной экспозиции на N15, мг N на 100 г сырого веса растений, 1954 г.

gt;В содержании в растениях белкового азота и азота хлорофилла нет сколько-нибудь закономерных изменений, определяемых длительностью экспозиции растений на меченом азоте. Имеются лишь сравнительно незначительные отклонения в ту или другую сторону от исходного состояния растений. Только для азота конституционных белков при 72-часовой экспозиции растений на меченом азоте обнаружено заметное увеличение. Но

содержание небелкового органического азота (аминокислоты) по мере удлинения экспозиции непрерывно возрастает. Без сом- нения, новый (синтез белка и хлорофилла в растениях происходил в течение всего опытного периода, но прирост этих веществ за сравнительно короткое время опыта был недостаточен для того, -чтобы его можно было учесть химическим анализом. Но между сериями опыта с нормальным освещением и затемнением имеются вполне доказуемые различия. При затемнении растений содержание в них всех фракций азота было несколько ниже, чем в растениях с нормальным освещением. Это дает известные основания считать, что синтез всех азотистых органических соединений растений в темноте происходит медленнее, чем на свету.

Результаты изотопного анализа фракций азота, выделенных из растений этого опыта, приведены в таблице 11.

Таблица П

Результаты изотопного анализа отдельных фракций азота, выделенных из зеленой массы молодых растений овса, 1954 г.

А. Опыт в условиях нормального освещения

Приведенные в таблице И данные изотопного анализа отдельных фракций азота, выделенных из растений с нормальным освещением, хорошо согласуются с результатами уже рассмотренных опытов. Новым является только высокое обогащение изотопом N15 всех фракций азота, что значительно повышает

точность опыта и достоверность вытекающих из него выводов [30].

Пр,и затемнении растений степень обогащения изотопом N15 всех выделенных из растений фракций при всех сроках экспозиции растений-на меченой азотной ' подкормке была значительно ниже, чем для соответствующих фракций азота в опыте с нормальным освещением. Это прежде всего говорит о том, что интенсивность поступления азота в растение зависит от условий освещения: при недостатке света поступление азота в растение падает и интенсивность образования аминокислот в растениях понижается. Но и поступивший в растение и использовавшийся в нем на синтез аминокислот меченый азот включается в химический состав белков при затемнении растений медленнее, чем на свету. В итоге интенсивность синтеза и обновления белка в растениях при затемнении значительно понижается. Таким образом, свет является важным фактором в азотном питании и обмене растений. Очевидно, синтез аминокислот, и в особенности белка в зеленых растениях, непосредственно сопряжен с фото- синтетическим процессом, но установление причинных связей между этими процессами требует дальнейших исследований. Что касается влияния условий освещения на обновление хлорофилла, то, судя по измерениям степени обогащения азота хлорофилла изотопом N15 для двух сроков экспозиции растений на меченой азотной подкормке, можно лишь утверждать, что обновление азота хлорофилла происходит и в темноте, но в какой степени изменяется интенсивность этого процесса в сравнении с растениями на свету, по полученным в этом опыте единичным данным судить нельзя.