ПРИМЕНЕНИЕ ИЗОТОПА N15 В АГРОНОМИЧЕСКОЙ ХИМИИ [36]

Использование стабильного изотопа N15 в агрохимических и биохимических исследованиях имеет известное преимущество перед другими радиоактивными изотопами, заключающееся в том, что N15 по своему действию на живой организм в любой концентрации ничем не отличается от обычного азота.

Если принять за единицу это соотношение, то всякий избыток атомов N15 характеризует степень обогащения данного соединения изотопом N15. Применяя в опытах меченные по N15 азотные удобрения, мы получили информацию о скорости поступления азота и его передвижения по отдельным органам растения, об использовании его на синтез аминокислот, белка и других веществ в растении, о судьбе внесенного азотного удобрения в почве и т. д. [4—5].

Полученные данные указывают прежде всего на исключительно высокую интенсивность обмена азотных веществ в растении. Первая стадия в усвоении растениями минеральных соединений азота (нитратов или аммонийных солей)—поступление их в растение — происходит с весьма высокой скоростью.

Поступивший в растение минеральный азог сразу же используется на синтез аминокислот в корнях растений. При снабжении растений аммонийными соединениями азота в дозах, обычно применяющихся в практических условиях, переработка его в аминокислоты полностью завершается в корнях растений и в листья уже поступают готовые аминокислоты,gt; которые используются здесь на синтез белка. Нитратные соединения азота, прежде чем пойти на синтез органических веществ, должны предварительно восстановиться в растении, поэтому использование нитратов в корнях на синтез аминокислот проис

ходит только в меру их восстановления в аммиак, значительная часть поступивших в корни нитратов достигает листьев, где они после восстановления используются на синтез аминокислот.

Переработка аммонийного азота в аминокислоты характеризуется весьма высокой скоростью. В таблице 1 приведены результаты одного из опытов, в котором изучалась скорость образования аминокислот в корнях и листьях молодых растений овса при подкормке их сульфатом аммония с 30-кратным обогащением изотопом N15.

Таблица 1

Интенсивность включения меченого азота в состав аминокислот молодых растений овса

Приведенные здесь данные обогащения указывают, во сколько раз в азоте исследуемых объектов содержится больше атомов N15, чем в природном азоте.

Процент меченого азота в исследуемом объекте вычисляется по формуле

где Zi — обогащение N15 исходного источника азота, взятого для подкормки растений, Z — обогащение исследуемого соединения азота.

Данные таблицы 1 показывают, что потребовалось очень немного времени для того, чтобы корни растений могли извлечь из почвы и переработать в аминокислоты^ достаточно значительные количества минерального азота: уже через 15 минут после внесения меченого сульфата аммония его азот был обнаружен в корнях растений в составе аминокислот. В дальнейшем содержание меченого азота в составе аминокислот корней непрерывно возрастало, что свидетельствует о непрекращаю- щемся их новом синтезе за счет внесенного в подкормку меченого азота сульфата аммония.

Синтезированные в корнях аминокислоты непрерывно отводятся в надземные органы растений. Передвижение аминокислот из корней в листья требует известного времени. В данном опыте для этого требовалось около двух часов. Исследования,, проведенные с применением хроматографического метода, показали, что синтез отдельных аминокислот за счет поступившего в растения неорганического азота (аммиачного или нитратного, безразлично) осуществляется в определенной последовательности.

Первой аминокислотой, образующейся в'корнях растений сразу же после внесения азотной подкормки, является аланин, затем через сравнительно короткое время образуются дикарбо- новые аминокислоты (аспарагиновая и глутаминовая кислоты)* но в значительно меньшем количестве, чем аланин. Синтез диаминокислот и ароматических аминокислот происходит в значительно более поздние сроки и главным образом в листьях, по-видимому, за счет аминных групп аланина и дикарбоновых аминокислот в результате реакций переаминирования.

Тот факт, что первой аминокислотой, синтезируемой растениями за счет переработки аммиака, является аланин, по-видимому, обусловлен тем, что в растениях в качестве постоянного метаболита в процессе дыхания всегда образуется пиро- виноградная кислота, которая при взаимодействии с аммиаком очень легко дает аланин.

Исследования с применением N15 показывают, что меченый азот может быть обнаружен в значительных количествах в составе белков уже в первые сутки после внесения меченой азотной подкормки, как это видно из данных таблицы 2.

Таблица 2

Динамика включения меченого азота в азот аминокислот и белков листьев молодых растений овса

При вычислении процентного содержания меченого азота за 100 принималась величина обогащения изотопом N15 сульфата аммония, применявшегося для подкормки. ч Процент меченого азота во фракции аминокислот одновременно выражает степень обновления азотистого состава аминокислот, так как для их синтеза непосредственно используется внесенный в под

кормку аммиачный азот сульфата аммония. Но на синтез белков используется не аммиак как таковой, а продукты его переработки, т. е. аминокислоты. Следовательно, при вычислении степени обновления белка мы должны исходить из экспериментально найденной на каждый момент степени обогащения изотопом N15 аминокислотной фракции азота, принимая эту величину за 100 и относя к ней экспериментально найденную величину обогащения изотопом N15 белковой фракции азота.

Как видно, азотистый состав белка в течение 48 часов обновился примерно наполовину, так как около 50% всех атомов* азота белка за 48 часов после внесения меченого сульфата* аммония было замещено «новыми» мечеными атомами азота.

Проводившиеся одновременно химические анализы растений показали, что общее количество белкового азота как в этом, так и в другом аналогичном опыте за столь короткие промежутки времени практически почти совсем не изменялось или изменялось на сравнительно незначительную величину (в пределах 5—10%). Это свидетельствует о том, что в растениях, кроме образования нового количества белка, постоянно происходит обновление уже содержащегося в растении белка. Таким образом, молекулы белка в организме растений имеют сравнительно небольшую продолжительность жизни. Они непрерывна разрушаются и вновь воссоздаются в процессе интенсивного обмена веществ растений.

Скорость обновления белка может быть рассчитана по такому уравнению:

О

где И — средний коэффициент обновления за время от 0 до t; ZA — обогащение изотопом N15 азота аминокислот;

Zb — обогащение изотопом N15 азота белка.

В ряде опытов, проведенных с различными растениями, было показано, что наиболее интенсивно протекает процесс обновления белка в листьях молодых растений. В этих опытах средняя скорость обновления, выражаемая величиной коэффициента И, колебалась в пределах 0,015—0,02 в час. При такой скорости «период полуобновления» белка t (время, в течение которого обновляется половина всех молекул), исходя из соотношения Т = -рр , был равен 35—40 часам. Это намного?

превышает скорость обновления белка в организме животного,, где, по данным Спринсона и Риттенберна, 1948 г. [6], а также- Бартлета и Геблера, 1952 г. [7], период полуобновления белкам вычисленный по результатам опытов с введением в пищу глицина, меченного по N15, колеблется в пределах 17—18 дней.

Столь высокая скорость обновления белка в высших растениях, по-видимому, связана с автотрофным типом питания, определяющим высокую интенсивность обмена веществ в растительной клетке. По мере старения растений интенсивность обновления белка падает. Такое же явление наблюдается и при неблагоприятных условиях роста растений, например при недостатке элементов питания, при неудовлетворительном водном режиме, при избыточной кислотности среды и т. п.

Синтез белка и его обновление в растениях тесно связаны с процессом фотосинтеза.

В живой растительной клетке в пластидах хлорофилл находится в виде комплекса его с белком и липоидами, и одновременно с обновлением белка происходит и обновление хлорофилла. Таким образом, молекулы хлорофилла, так же как и белковые молекулы, постоянно разрушаются и вновь синте: зируются. Скорость обновления молекул белка и хлорофилла n. выражается величинами одного порядка.

При экспозиции растений в темноте в отсутствие сахаров нового синтеза белка и его обновления не происходит [8].

В этих условиях происходит только непрерывный распад белка до аминокислот, а при более длительной экспозиции растений в темноте происходит дезаминирование аминокислот с образованием в качестве продукта их распада — аммиака. Одновременно с распадом белка происходит и распад хлорофилла. Это можно видеть из данных таблицы 3.

Таблица 3

Азотный обмен в молодых растениях овса на свету и в темноте

В темноте меченый атом включался только в состав аминокислот, для синтеза которых наличие света не является необходимым, содержание же меченого атома в белке и хлорофилле в темноте ничтожно мало и не выходит за границы возможной ошибки эксперимента.

Прекращение синтеза белка и хлорофилла в темноте в значительной мере обусловлено тем, что в этих условиях в растениях не образуются сахара, наличие которых является необходимым для синтеза как белка, так и хлорофилла. В ряде опытов, где исходные растения характеризовались весьма высоким содержанием сахаров, в первое время их экспозиции в темноте распада белка и хлорофилла не наблюдалось. Только после того, как первоначальные запасы сахаров в растениях были истощены, начинался процесс распада белка и хлорофилла.

Опытами, проведенными в строго контролируемых условиях^ установлено, что степень обеспеченности растений сахарами имеет наибольшее значение не для начальных этапов усвоения неорганического азота растениями, а для конечного этапа переработки азотистых соединений, для синтеза белка. В среднем из ряда опытов установлено, что синтез 1 г белка в растениях сопровождается затратами примерно 5 г сахара. По-видимому, синтез белка сопровождается интенсивным окислением сахара, в результате которого' освобождается энергия, необходимая для активации молекул аминокислот, вступающих в реакцию синтеза белка.

Применение изотопа N15 при изучении биологической фиксации атмосферного азота в клубеньках бобовых позволило установить новые положения -о механизме этого процесса [9]. Был разработан метод препаративного выделения бактерий из клубеньков бобовых, и это позволило детально изучить распределение меченого азота как в отдельных фракциях и органах высшего растения, так и в клубеньковых бактериях.

Бобовые растения — горох, клевер, люцерна — в этих опытах выращивались в обычных вегетационных .сосудах, .и в период наиболее интенсивной фиксации атмосферного азота сосуды с растениями помещались в специальную стеклянную камеру, куда вводился газообразный азот, обогащенный изотопом N15.              -

В результате этих исследований было найдено, что фиксированный бобовыми меченый газообразный азот атмосферы первоначально в больших количествах содержится только в клеточном соке клубеньковой ткани, представляющей гипертрофированную корневую ткань бобовых, откуда он затем постепенно переходит в другие органы растений. В клубеньковых бактериях меченый азот'при экспозиции растений от 6 до 48 часов совершенно отсутствует или содержится в крайне незначительных количествах, обычно не выходящих за пределы возможной ошибки эксперимента (табл. 4).

Только при длительной экспозиции люцерны в атмосфере N15 (90 часов) меченый азот был обнаружен в некоторых количествах /В бактериях, но концентрация его и в этом случае была намного ниже, чем в клеточном соке клубеньковой ткани или в составе азотистых фракций других органов растения.

Обогащение изотопом N15 и содержание меченого азота в клубеньковых бактериях и в клеточном соке клубеньковой ткани корней люцерны

Это указывает, что фиксированный меченый азот попадает в тела бактерий из тканей высшего растения, которое является источником азотного питания для бактерий. Таким образом, фиксация атмосферного азота локализована не в теле клубеньковых бактерий, а в клубеньковой ткани высшего растения. Важная роль клубеньковых бактерий заключается в том, что они индуцируют образование этой специфической клубеньковой ткани. Дальнейшие исследования показали, что максимальное содержание меченого азота в отдельных азотистых фракциях клеточного сока клубеньков всегда приходится на амидную группу аспарагина и глутамина. Так как эта группа может рассматриваться как трансформированный аммиак, то именно аммиак и является конечным неорганическим продуктом биологической фиксации азота.

Применение изотопа'' N15 при изучении превращения азотных удобрений в почве [10] позволило установить следующие положения.

Из внесенного в почву азота меченого азотного удобрения растения за один сезон используют от 50 до 75%.

От 10 до 35% от общего количества внесенного азота приходится на прямые его потери из почвы, происходящие в результате микробиологических процессов. При этом размер потерь зависит от времени внесения азотных удобрений; минимальные потери были в том случае, когда удобрения вносились одновременно с посевом; при внесении азота в почву за 2 месяца до посева эти потери значительно возрастали и были наиболее высокими при внесении удобрений за год до посева.

Около 20% от внесенного азота использовалось почвенными микроорганизмами на построение их тела и таким образом превращалось в азот органического вещества почвы. Изучение степени минерализации и доступности растениям меченого азота, трансформированного в почве в органическую форму, показало, что на второй год после его внесения минерализовалось

и использовалось растениями около 10% от всего перешедшего в органическое вещество почвы (т. е. в микробную плазму) меченого азота. Интенсивность минерализации этого азота оказалась примерно в 15 раз выше в сравнении с основным фондом «старого» органического азота почвы.

. Внесение меченного по N15 сульфата аммония на всех исследованных почвах вызывало весьма значительное увеличение степени использования растениями природного азота почвы. Это можно объяснить тем, что образующиеся при нитрифика- ции сульфата аммония (и вообще любого нитрифицирующего источника азота) кислотные продукты усиливают гидролиз органического почвенного азота и тем самым повышают его подвижность.

ЛИТЕРАТУРА

1. Соколов А. В. Вестник АН СССР, № 9, 1953.
2. Соколов А. В. Доклады СССР на Международной конференции по мирному использованию атомной энергии. М., 1955.
3. С око л о в А. В. «Почвоведение», № 2, 1958.
4. Турчин Ф. В., Гу минская М. А., Плышевская Е. Г. Изв. АН CCCI^, сер. биол № 6, 1953.
5. Турчин Ф. В., Гуминская М. А., Плышевская Ё. Г. Доклады сессии АН СССР по мирному использованию атомной энергии, М., 1955.
6. Sprinson D., Rittenberg D. J. Biol. Chem. 180, 2, (1949).
7. В a г t e t P. D., G a e b u г О. H. ibid 196, 1 (1953)
8. Го дне в Т. Н., Турчин Ф. В., Шлык А. А. Доклады Международной конференции по применению радиоизотопов в научных исследованиях Лондон, 1957.
9. Турчин Ф. В., «Почвоведение», № 10, 1959.

10. Турчин Ф. В., Берсенева 3. Н., Корицкая И. А., Жидких Г. Г., Лобовикова Г. А. Доклады VII Международного конгресса по почвоведению. Медисон, США, 1960.