RAPD-ПЦР

Как можно видеть, современная фитопатология располагает целым рядом основанных на ПЦР возможностей диагностики патогенов. При этом доступность информации, полученной в результате секвенирования генома фитопатогенов, является существенным условием, поскольку исследователю полезно иметь представление о последовательности ДНК, которую предполагают использовать для детекции и идентификации возбудителя болезни.

Так как специфичность ПЦР обусловлена праймерами, важным требованием для успеха ПЦР-анализа любого типа является их подбор.
Поскольку относительно небольшие геномы вирусов и вироидов расшифрованы, и в соответствующих базах данных доступна полная информация об их последовательностях, подбор праймеров для анализа их ДНК или РНК не представляет большой проблемы. Меньше информации собрано о геномах бактерий, оомицетов и грибов, хотя объем данных постоянно и быстро растет. ПЦР-диагностика этих патогенов может осуществляться как на основе анализа известных последовательностей целевого фрагмента ДНК, так и на амплификации ее случайно выбранного региона.
В качестве целевой последовательности для бактерий, оомицетов и грибов обычно используют ДНК, кодирующую рибосомальную РНК (рДНК). Несколько фактов делают рДНК подходящей для целей диагностики. Во-первых, в клетке присутствует много копий рДНК, что увеличивает чувствительность детекции. Во-вторых, гены рДНК присутствуют во всех организмах и содержат высоко консервативный 5.8S-pernoH, который делает возможность детекции на основе рДНК универсальной. В то же время, данная последовательность содержит высоко вариабельные регионы, такие как внутренние транскрибируемые сайты (ITS). Консервативные регионы могут быть использованы для подбора универсальных праймеров при детекции группы микроорганизмов внутри крупного таксона (для всех оомицетов, грибов или бактерий), в то время как наличие вариабельных регионов позволяет выявить разные расы, штаммы и изоляты. Другие последовательности, используемые для детекции грибов — это

гены «домашнего хозяйства», например, гены бета-тубулина или гены, 97 связанные с устойчивостью к фунгицидам. У бактерий источником целевых фрагментов обычно служат плазмидная ДНК и гены, связанные с патогенностью.
Если целевая последовательность не известна, подходящим методом является ПЦР с произвольной амплификацией полиморфной ДНК (Random Amplification of Polymorphic DNA — RAPD) или ПЦР с вырожденными праймерами. Другое название RAPD-ПЦР — ПЦР с произвольными праймерами (Arbitrary Primed PCR — AP-PCR). Метод RAPD-ПЦР, особенно в сочетании с анализом полиморфизма по длине фрагментов рестрикции (restriction fragment length polymorphism — RFLP) нашел широкое применение при исследованиях полиморфизма ДНК, картировании генов, а также в популяционной генетике и эволюционной биологии.

В диагностике фитопатогенов, RAPD-ПЦР используют, когда необходимо обнаружить последовательности, специфичные для близкородственных видов, штаммов, рас и изолятов, чтобы различить их. Данный метод требует проведения тщательной очистки анализируемой ДНК.
В противоположность выше упомянутым видам ПЦР-анализа, где используются два праймера, ограничивающие последовательность амплико- на, при RAPD-ПЦР происходит отжиг одного праймера небольшого размера, который комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых патогенов. Праймер связывается с комплементарными последовательностями геномной ДНК, и после амплификации, образуются продукты произвольной длины, которые ограничены на обоих концах случайно отожженной последовательностью частично или полностью гомологичной праймеру. Полиморфизм ДНК, вызванный вставками, делениями или заменами оснований, приводит к тому, что у разных организмов образуются как одинаковые, так и разные продукты RAPD-ПЦР, что выражается в наличии или отсутствии совпадающих или несовпадающих полос в геле после электрофореза. Подбирая условия реакции, удается добиться отличающихся картин ПЦР для последовательностей из близкородственных фитопатогенов, когда часть полос будет специфична только для конкретного организма. Чтобы получить картину разделения, характерную для целевого организма, необходимо протестировать много разных праймеров. Последовательности из выявленных специфичных полос могут быть использованы для синтеза высокоспецифичных праймеров.
Завершая описание методов, основанных на анализе нуклеиновых кислот, следует отметить, что ПЦР не единственный способ диагностики фитопатогенов с привлечением амплификации. Так, некоторые патогены растений были идентифицированы с помощью лигазной цепной реакции (ЛЦР Ligase Chain Reaction — LCR), которую катализирует ДНК-зависимая ДНК-лигаза. Данный фермент способен сшивать цепь ДНК в присутствии аденозин трифосфата (АТФ) и ионов Mg2+, по месту разрыва фосфодиэфир- ной связи. ЛЦР позволяет выявлять точечные мутации возбудителей заболеваний. Применимость ЛЦР в диагностике фитопатогенов может быть

98 проиллюстрирована примерами ее использования для детекции вирусов картофеля А и У в клубнях, идентификации Erwinia stewartii, а также дифференциации оомицетов Phytophthora infestans, Р mirabilis и Р phaseoli от других видов рода Phytophthora. В последнем случае LCR была применена совместно с ELISA.

<< | >>

↑

Источник: Под ред. Ю. Т. Дьякова. Фундаментальная фитопатология. 2011

Еще по теме RAPD-ПЦР:

- Агрохимия и агропочвоведение - Животноводство и промыслы - Защита растений - Земледелие - Овощеводство - Плодоводство - Пчеловодство - Растениеводство - Сад и огород - Селекция и семеноводство с/х культур - Сельскохозяйственные мелиорации -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -