Метод микроэррэй-анализа (Microarray)

Одной из стоящих на повестке дня задач современной фитопатологии является обнаружение одного или сразу нескольких фитопатогенов среди других патогенных и непатогенных микроорганизмов в микробных сообществах и биологических матрицах.

Интересное решение этой задачи дает использование так называемой «обратной гибридизации», при которой применяют следующую методику. Набор из контрольных последовательностей ДНК фитопатогенов, которые подлежат определению, фиксируют на подходящем носителе, а в качестве комплексного зонда выступает тотальная ДНК, выделенная из образца (растительной ткани, почвы и проч.), в которую вводят флуоресцентную метку. Обычно предварительно ДНК амплифицируют посредством ПЦР. Гибридизация с контрольными ДНК приводит к определенной картине распределения положительных сигналов, которая показывает, что искомый организм содержится в анализируемом образце. Таким образом, в одном эксперименте может быть выявлено и идентифицировано несколько микроорганизмов.
В настоящее время в области диагностики фитопатогенов этот подход развивается в сторону увеличения числа одновременно определяемых возбудителей. В перспективе их число может быть доведено до сотен и тысяч. Такая высокоемкая диагностика имеет вполне реальное будущее,

благодаря появлению технологии создания биочипов, или ДНК-чипов 95 (в англоязычной литературе эту технологию принято называть microarray или gene array).
Микроэррэй-анализ, одно из последних достижений молекулярной биологии, является мощным инструментом функциональной геномики. Впервые он был применен в 1995 г. для одновременного анализа экспрессии большого числа генов. Используя технологию биочипирования, в одном эксперименте сейчас анализируют сотни (macroarray) и тысячи (microarray) генов одновременно. Этот метод обладает гигантским потенциалом в отношении обнаружения, идентификации и генотипирования патогенов, в том числе, поражающих растения. Для практической диагностической фитопатологии появление микроэррэй-анализа имеет важное значение, поскольку в природе растение обычно инфицировано несколькими патогенами, которые к тому же могут действовать совместно, вызывая комплексное заболевание. .
При создании матрицы используют роботы, которые наносят специфичные последовательности ДНК патогенов (ПЦР продукты, клонированные гены и т. п.) в ячейки на специальную подложку (обычно из нейлона или стекла). Готовая матрица (чип) содержит множество ячеек «заряженных» нуклеотидными последовательностями, специфичными для множества различных патогенов.

ДНК анализируемого образца амплифицируют с помощью ПЦР, метят флуоресцирующими красителями и гибридизуют с матрицей. Если последовательность в какие-либо из ячеек биочипа оказывается комплементарной определяемой ДНК, последняя связывается с ней, и после облучении светом определенной длины волны в этих ячейках появляется свечение. По характеру и интенсивности флуоресцентного свечения с помощью специального сканера-анализатора определяют количество характерных последовательностей ДНК. Этим способом было, например, обнаружено несколько видов бактерий, а также оомицетов — представителей родов Phytophthora и Pythium среди других микроорганизмов в образцах почвы. Кроме того, созданы биочипы для вирусов, в частности нескольких вирусов картофеля и вируса мозаики огурца, вироида верете- новидности клубней картофеля и фитобактерий родов Xanthomonas и Xylella. В качестве гибридизационных зондов при микроэррэй-анализе часто используют зонды типа PLP (Padlock probe) — длинные нуклеотидные последовательности, 5 - и 3-концы которых комплементарны целевым последовательностям патогена, и которые в молекулах ДНК или РНК распознают близко расположенные участки. Такие зонды разработаны, например, для четырех видов Phytophthora, Pythium ultimum, Fusarium oxysporum, Verticillium dahliae и Rhizoctonia solani. Одним из перспективных направлений применения микроэррэй-анализа в настоящее время является обнаружение карантинных объектов при необходимости контроля больших партий подлежащих проверке образцов.
Для обнаружения и идентификации фитопатогенов используют также другой тип матрицы, называемый наночипом, в котором электродная мат-

96 рица обеспечивает непосредственный контроль транспорта электрически заряженных молекул в микрозоны связывания их с иммобилизованными биотинилированными олигонуклеотидными зондами или продуктами ПЦР. Регулируя напряженность электрического поля, можно создать более строгие условия для гомологичной гибридизации и тем самым повысить специфичность диагностики. Оказалось, что наночипы позволяют выявлять у патогенов различия на уровне одного нуклеотида. Они были использованы для идентификации вирусов картофеля (Y, X и вирус скручивания листьев), а также фитопатогенных бактерий (Ralstonia solanacearum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, P carotovorum subsp. atrosepticum, P chry- santhemi и Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus).

Еще по теме Метод микроэррэй-анализа (Microarray):

1.   МЕТОДЫ ОБЩЕГО КЛИНИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КРОВИ  
2.   ГЛАВА 4 МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
3. Экологическая пластичность и методы ее анализа
4. АНАЛИЗ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ ОСУШЕННЫХ ТОРФЯНЫХ ПОЧВ МЕТОДОМ FISH Е. В. Менько, И. К. Кравченко
5. Методы профилактики развития резистентности паразитов к препаратам Биологические методы.
6. Анализ ситуаций
7. Анализ моделей и сценариев
8. Анализ по С.П. Мартынову
9.   КЛИНИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МОЧИ  
10. 14.3.6. Корреляционный анализ растительности
11. Анализ среды обитания животных