ОЦЕНКА СОСТАВА МЕТАНОГЕННЫХ АРХЕЙ В ТОРФЯНЫХ ПОЧВАХС ПОМОЩЬЮ ПЦР-ДГГЭ ТЕХНОЛОГИИ А.              К. Кизилова, М. В. Чистотин, И. К. Кравченко

alegrria@gmail.com

** Учреждение Российской академии наук Институт лесоведения РАН,

Успенское, Одинцовский район, Московская обл.

С помощью ПЦР-ДГГЭ методов, основанных на анализе 16S рРНК, проведено исследование разнообразия архей в торфяных почвах осушенных торфяников и естественных болот Дубненского болотного массива (Талдомский район, Московская обл.). Установлено, что в составе метаногенных сообществ преобладают организмы, наиболее близкие к представителям порядка Methanosarcinales. Наряду с метаногенами в торфяных почвах обнаружено значительное количество некультивируемых представителей Crearchaeota.

Введение

Торфяные почвы, широко распространённые в России, являются одним из основных естественных источников поступления метана в атмосферу нашей планеты. Вклад метана в парниковый эффект составляет 30 % от вклада диоксида углерода, при этом метан примерно в 20 раз более активен [1]. В болотах законсервировано большое количество органического вещества, которое при вмешательстве человека и осушении болот для их последующего сельскохозяйственного использования, разлагается с выделением диоксида углерода и метана [2]. Наиболее заметные антропогенные изменения потоков метана из торфяных почв связаны с осушением и освоением болот для добычи торфа и сельскохозяйственного использования. В России насчитывается более 5 млн. га мелиорированных для сельского хозяйства избыточно увлажненных земель, большей частью представленных торфяными почвами [3], однако сведения о закономерностях газообмена метана в этих почвах крайне ограничены, а данные о составе и разнообразии микроорганизмов, ответственных за образование и поступление метана в атмосферу отсутствуют. Цель настоящего исследования состояла в изучении метаногенных сообществ естественных, осушенных и искусственно залуженных торфяников с помощью методов молекулярной экологии.

Материалы и методы

Исследования проводили с образцами торфяных почв осушенной части Дубненского болотного массива в Талдомском районе Московской области (56°42' с.ш., 37°50' в.д.), который был частично осушен в 1979 году для добычи торфа и сельскохозяйственного использования. В настоящее время добыча торфа ведется лишь на нескольких участках, большинство торфоразработок были залужены и сейчас частично используются для сенокошения и выращивания овощных культур. Почва была отобрана в октябре 2009 г. с тех участков, на которых проводятся регулярные полевые измерения эмиссии углеродсодержащих парниковых газов [4] и в вегетационном опыте, моделирующем стадии создания сенокоса на осушенной торфяной почве (табл. 1).

Выделение ДНК. Выделение тотальной ДНК из торфяных почв проводилось с помощью готового набора реактивов PowerSoil DNA Kit, MO BIO, США, согласно рекомендациям производителя.

Полимеразная цепная реакция. Использовали систему праймеров 344F-915R [5], которая позволяет амплифицировать фрагмент гена 16s РНК архей длиной около 570 пар нуклеотидов. Смесь для проведения реакции состояла из буфера (2,5 mM MgCl2) и полимеразы (1,25 U) производства компании Хеликон, праймеров (0,5 mM/ml каждого праймера), смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (0,2 mM/ml каждого NTP), бычьего сывороточного альбумина (0,2 mM/ml). Амплификация проводилась на термоциклере MyCycler (BioRad) со следующим температурным профилем: начальная денатурация 94 °С - 5 минут, затем 20 циклов, состоящих из денатурации 94 °С - 1 минута, отжига праймеров 71 °С с последующим понижением температуры на полградуса каждый цикл - 1 минута, и удлинения цепи 72 °С - 3 минуты. Заключительная стадия ПЦР состояла из 15 циклов денатурации 94 °С - 1 минута, отжига праймеров 61 °С - 1 минута, и элонгации фрагмента ДНК - 3 минуты. Финальная элонгация шла 5 минут при 72 °С.

Таблица 1

Объекты наблюдений

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез и секвенирование.

Результаты и обсуждение

Проведенные исследования in situ установили, что осушенные и используемые под сенокос торфяные почвы выделяют значительное количество метана в атмосферу (рис. 1)

Применение вышеописанной системы праймеров позволило выявить архей во всех почвах, кроме неосушенного болота (образец 7). Отсутствие сигнала, возможно, объясняется повышением в месте отбора образца, где, по всей вероятности, не соблюдались условия, необходимые для развития данных организмов. Для остальных 6 образцов были успешно получены и разогнаны на полиакриамидном геле ПЦР-продукты (рис. 2). Для дальнейшего анализа была вырезана и реаплифицирована 21 полоса. Обнаруженные археи не ограничивались метаногенами - во многих образцах были детектированы представители Crenarchaeota (табл. 2).

В образцах торфоразработок были, в основном, выявлены некультивируемые представители кренархей и несколько эвриархей, которые пока не были идентифицированы. Что касается торфяников, подвергавшихся сельскохозяйственной обработке, архей в них оказалось довольно много, и все они проявили высокое сходство (95-96 %) с метаногенами рода Methanosarcina и других представителей порядка Methanosarcinales.

большее количество метана по сравнению с остальными образцами, что подтверждается наличием в них метаногенных архей рода Methanosarcina и порядка Methanosarcinales. Неосушенное болото, в котором археи не были обнаружены, также характеризуется почти нулевой эмиссией метана. В вегетационном опыте археи представлены некультивируемыми формами кренархей и эвриархей, часть из которых показало высокое сходство с Methanosarcina sp. (96 %). Интересно отметить присутствие в образцах представителей Methanobacteriales, которые не были выявлены в образцах почв торфяников.

Таблица 2

Разнообразие архей в торфяных почвах Талдомского района

Выводы Изучение состава метаногенных сообществ различных торфяных почв методом ПЦР-ДГГЭ показало, что среди метанобразующих архебактерий представители рода Methanosarcina и порядка Methanosarcinales.

Литература Бажин Н. М. Метан в атмосфере // Соросовский образовательный журнал. Химия. - 2000. Т.6.- № 3. - С. 52-57. Oleszczuk R., Regina K., Szajdak L., ^per H., Maryganova V. Impacts of agricultural utilization of peat soils on the greenhouse gas balance. In: Edited by Maria Strack. Peatlands and climate change. 2008.- Jyvaskyla: International Peat Society. - P. 70-97. Торфяные болота России: к анализу отраслевой информации / Под ред. А. А. Сирина, Т. Ю. Минаевой. - М.: Геос, 2001. - 190 с. Чистотин М. В., Сирин А. А., Дулов Л. Е. Сезонная динамика эмиссии углекислого газа и метана при осушении болота в Московской области для добычи торфа и сельскохозяйственного использования // Агрохимия. - 2006. - №6.- С. 54-62. Casamayor E. O., Schafer H., Baneras L., Pedros-Alio C., Muyzer G. Identification of and spatio- temporal differences between microbial assemblages from two-neighboring sulfurous lakes: comparison by microscopy and denaturing gradient gel electrophoresis // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - № 66. - P. 499-508.

STUDYING METHANOGENIC COMMUNITIES

OF PEAT SOILS BY MEANS OF PCR-DGGE TECHNIQUE K. Kizilova, M. V. Chistotin, I. K. Krachenko

PCR-DGGE technologies, based upon 16S RNA, were used for assessing diversity of methanogenic archaea in peat soils of drained peat bogs and natural bogs of Dubna bog territory (Taldom district, Moscow region). Our research showed that most abundant archae were most closely related to Methanosarcinales. Moreover, along with methane- producing microorganisms, lots of non-methanogenic uncultured Crenarchaea were detected.

УДК 633.2:504.03