Обсуждение результатов исследований

С середины 80-х гг. XX столетия в области клинической микологии были отмечены тенденции к расширению видового состава возбудителей микозов. Был накоплен фактический материал, демонстрирующий, что патогенным потенциалом обладает гораздо большее число видов грибов, нежели было принято считать.

Возросло число микозов, развивающихся на фоне снижения резистентности макроорганизма, для обозначения которых был введен термин «оппортунистические микозы». Именно они находятся сегодня в фокусе внимания медицинских и ветеринарных микологов. Предрасполагающими факторами к возникновению оппортунистических микозов могут являться иммунодефи- цитные, инфекционные и другие заболевания, применение антибиотиков и гормональных препаратов, неблагоприятные внешние условия. Учитывая разнообразие негативных факторов, оказывающих постоянное воздействие на организм животных в современных условиях и ослабляющих их иммунный и физический статус, тенденция к распространению оппортунистических микозов представляется закономерной.

Оппортунистические микозы животных, вызываемые дрожжевыми грибами рода Malassezia, начиная с 1990-х гг., являются одной из наиболее насущных проблем в ветеринарной микологии [63, 169, 109]. Malassezia- инфекции имеют повсеместное распространение, им подвержены многие виды домашних животных, в то время как существующие методы диагностики и терапии этих микозов недостаточно эффективны [137].

На территории РФ распространенность и этиологическая структура Malassezia-инфекций животных практически не изучалась. Информированность практикующих ветеринарных врачей о данном заболевании находится в целом на низком уровне, из-за чего больные животные не получают долж-

ную ветеринарную помощь.

Первоочередным условием эффективной борьбы с заболеванием является наличие доступного и объективного метода диагностики. Проведенные в данной работе исследования позволили предложить алгоритм лабораторной диагностики Malassezia-инфекций животных, применимый в условиях повседневной ветеринарной практики. В основе алгоритма лежит культуральный метод. Хотя цитологический метод выявления грибов рода Malassezia менее затратен, однако, по данным ряда сравнительных исследований, чувствительность его значительно ниже культурального [52, 135, 97].

По данным С. Cafarcia et al. [46], чувствительность цитологического метода составляет лишь 30%. Еще одним бесспорным преимуществом культурального метода является возможность определения чувствительности выделенного гриба к антифунгальным препаратам, что дает возможность выбрать оптимальное средство терапии в конкретном случае.

Учитывая, что грибы рода Malassezia являются частью нормальной мик- робиоты кожи и слухового канала животных, для диагностики Malassezia- ифнекций имеет значение не только факт выделения гриба, но и оценка плотности его популяции. Проведенные исследования показали, что плотность популяции Malassezia spp. в слуховом канале здоровых собак составляет в среднем 7,0 КОЕ в пробе, при этом гриб был выделен у 29,6% обследованных животных. По литературным данным, частота обнаружения грибов рода Malassezia у здоровых собак колеблется в пределах от 11 до 45,5% [127, 46,103].

У собак с признаками хронического отита плотность популяции Malassezia spp. по нашим данным составляла в среднем 216,1 КОЕ в пробе при частоте выделения 88,2%. Эти данные подтвердили, что плотность попу-

ляции грибов в слуховом канале больных отитом собак в десятки раз выше, нежели у здоровых животных, т.е. многократное увеличение плотности популяции коррелирует с развитием патологического процесса и является диагностическим критерием.

Таким образом, в результате сравнительного изучения плотности популяции грибов рода Malassezia в слуховом канале здоровых собак и собак с клиникой хронического отита, были определены количественные критерии оценки клинической значимости гриба, использованные нами в дальнейших диагностических исследованиях.

[9].

Сравнительные исследования также позволили выявить оптимальный метод отбора проб патматериала от больных животных, условия и сроки сохранности возбудителя в патматериале, а также оптимальные питательные среды для выделения грибов рода Malassezia из патологического материала. Наиболее практичным способом отбора патматериала, по нашим данным, является использование ватного тампона-зонда в комплекте с коллектором с транспортной средой Эймса. Использование данной транспортной системы обеспечивает удобство отбора и транспортировки пробы, и сохранность в ней грибов рода Malassezia в течение 7 сут. при 5-8°С. Судя по литературным данным, транспортные системы при диагностике Malassezia-инфекций используются крайне редко [76]. Данные о сохранности жизнеспособности Malassezia spp. в образцах патматериала при различных условиях хранения в доступной литературе обнаружить не удалось.

Результаты культурального анализа во многом зависят от состава используемых питательных сред. По литературным данным [105] к настоящему

времени предложено не менее десяти различных питательных сред для выделения липофильных дрожжевых грибов.

Исходя из полученных нами экспериментальных данных, наилучших результатов при выделении грибов рода Malassezia позволяет добиться использование липид-содержащей среды Барфатини наряду со средой Сабуро (или сусло-агаром) с добавлением антибиотика. Необходимость использования липид-содержащей среды объясняется липид-зависимостью большинства видов рода Malassezia (таких как М. sympodialis, М. globosa, М. restricta, М. furfur, М. slooffiae), доля которых в этиологической структуре Malassezia- инфекций животных может достигать 42% [59]. Среда Барфатини для выделения липид-зависимых дрожжевых грибов рекомендована П.Н.

Использование среды Сабуро или сусло-агара с антибиотиком (в нашем случае хлорамфениколом) во-первых, исключает бактериальную контаминацию посевов, а во-вторых, позволяет сразу определить, является ли выделенный гриб рода Malassezia липид-зависимым, что облегчает видовую идентификацию. Кроме того, параллельный посев на указанные среды обеспечивает выделение и других микроорганизмов - бактерий, мицелиальных грибов, что также может представлять диагностическую ценность.

Предложенный диагностический алгоритм предусматривает идентификацию выделенных дрожжевых грибов на основании морфологии колоний, микроскопии культуры и определения его липид-зависимости. При росте на

липид-содержащих средах многие виды рода Malassezia образуют вокруг колоний зону преципитации липидов, заметную невооруженным глазом. В наших исследованиях отмечали образование таких зон на среде Барфатини, что может быть использовано как дополнительный критерий при идентификации [92]. Микроскопическую идентификацию грибов рода Malassezia проводят, исходя из формы дрожжевых клеток, способа почкования, соотношения ширины материнской и дочерней клеток [19]. Дрожжевые клетки имеют характерную форму «отпечатка стопы» или «земляного ореха», что в большинстве случаев позволяет безошибочно определить их принадлежность к роду Malassezia.

Что касается видовой идентификации, то наиболее значимым критерием здесь является липид-зависимость гриба. При наличии роста гриба на среде без липидов (Сабуро, сусло-агар), его идентифицируют как М.

Заключительным этапом предложенного диагностического алгоритма является определение чувствительности возбудителя к набору антифунгаль- ньгх препаратов диско-диффузионным методом, доступным в большинстве лабораторий. Таким образом, предложенный алгоритм регламентирует все этапы лабораторной диагностики Malassezia-инфекций — от отбора проб патматериала до определения оптимального терапевтического средства.

Предложенная диагностическая схема дала возможность приступить к изучению распространенности и этиологической структуры Malassezia- инфекций животных. Исследования выявили доминирующую роль грибов

рода Malassezia в этиологии поражений слухового канала (хронических отитов) у собак, она составила 80,4%. Полученные данные сопоставимы с результатами зарубежных исследований - по разным данным, доля Malassezia- отитов у собак составляет 57,3% [45], 63,7% [113], 72,1% [44], 69,8% [76], 80,4% [29], 82,1% [103].

У кошек Malassezia-отиты диагностированы в 11,8% случаев, однако по литературным данным, их распространенность может достигать 73% [45].

При изучении этиологии кожных поражений (дерматитов) у собак, этиологическая роль грибов рода Malassezia выявлялась достаточно редко - в 14,8%о случаев. Зарубежные авторы сообщают о более широкой распространенности Malassezia-дерматитов - 19,4% [142], 67,6% [134], 80% [135]. Malassezia-дерматиты у кошек в наших исследованиях не диагностированы. По литературным данным, у этого вида животных данные заболевания проявляются в основном как поражения когтей или межпальцевых пространств [145].

Во всех случаях диагностированных нами Malassezia-инфекций кошек и собак был идентифицирован только один вид возбудителя — М. pachydermatis, хотя использованная нами липид-содержащая среда позволяла изолировать и липид-зависимые виды рода Malassezia. Большинство авторов также диагностировали М. pachydermatis, как основной возбудитель Malassezia-инфекций кошек и собак [29. 103, 76].

Следует отметить встречаемость других микроорганизмов при поражениях слухового канала у собак. В чистой культуре М. pachydermatis был выделен из 52,4% проб, а в 25,2% - в ассоциации с бактериями (в основном кокковые формы). О частой встречаемости М. pachydermatis в ассоциации с бактериями сообщают и другие авторы - A. Kumar [103], G. Fernandez et al. [76] и другие. В исследованиях F. Breitweiser [44], ассоциация М. pachydermatis с бактериями рода Staphylococcus обнаружена в 31,8% случаев при отитах со-

бак, в то время как М. pachydermatis в чистой культуре был выделен из 21,9% проб. Приведенные данные подтверждают предположение о наличии симбиоза между грибами рода Malassezia и бактериями, и их консолидированной роли в патогенезе кожных и ушных заболеваний животных.

В единичных случаях при отитах собак (2,8%) нами были выявлены ассоциации М. pachydermatis с мицелиальными недерматофитными грибами (НДГ), а в 2,1% проб выявлены только НДГ (родов Mucor, Aspergillus, Peni- cillium, Alternaria). О выделении недерматофитных грибов при отитах собак сообщают A. Kumar et al. [103] и G. Fernandez et al. [76].

F. Bernardo et al. [29], наряду с грибами рода Malassezia, в 19% случаях выделяли и другие дрожжевые грибы родов Cryptococcus, Candida, Trichosporon. В наших исследованиях представители этих родов не диагностированы.

Изучение клинических особенностей Malassezia-отитов у собак продемонстрировало, что наиболее распространенной является церуминозная форма отитов, характеризующаяся повышенным образованием ушного секрета (церумена). Гнойная и себорейная формы, напротив, встречались относительно редко. Однако, по наблюдениям G. Fernandez et al. [76], доминирующей является гнойная форма Malassezia-отитов (60,4%), а церуминозная регистрируется у 35,8% больных животных. Среди других клинических признаков наиболее часто отмечали гиперемию, зуд, болезненность, что совпадает с наблюдениями других авторов [77].

Клиническая картина кожных поражений (дерматитов) у собак выражалась как правило в эритеме, мацерации, лихенизации кожного покрова, отмечали образование комедонов и жировую экссудацию. Аналогичные признаки, свойственные хроническим воспалительным процессам, отмечались и другими авторами [137].

Учитывая, что Malassezia-отиты в большинстве случаев носят затяжной хронический характер, сделать вывод о сезонности заболевания представля-

ется затруднительным. Однако, судя по частоте обращений за ветеринарной помощью, обострения хронических Malassezia-отитов как правило наблюдаются в весенний и осенний периоды. Вероятно, это обусловлено более высокой влажностью воздуха в эти периоды, что благоприятствует жизнедеятельности дрожжевых грибов [103]. Однако, V. Sharma et al., [159] не обнаружил корреляции между заболеваемостью Malassezia-отитами и погодными условиями (температурой и влажностью).

Проведенные исследования позволили установить наиболее характерные клинические особенности (клинические предикторы) Malassezia-инфекций животных. Хотя описанные признаки не специфичны только для Malassezia- инфекций и могут наблюдаться при заболеваниях другой этиологии, однако их наличие сигнализирует о необходимости проведения лабораторного микологического исследования.

При изучении эпизоотологических особенностей Malassezia-отитов у собак установлено, что самки имеют несколько большую предрасположенность к заболеванию, нежели самцы (60,9 и 39,1% соответственно). G. Fernandez [76] также выявил незначительную предрасположенность у самок (58%), a F. Bernardo et al. [29] - у самцов (86,8%). Однако другие авторы склоняются к отсутствию половой предрасположенности при Malassezia-OTHTax [103,159].

Среди различных возрастных групп выявлена предрасположенность к Malassezia-отитам у животных в возрасте 3-6 лет и старше, хотя могут болеть животные всех возрастов. В известных нам публикациях также отмечалась возрастная предрасположенность, которая колебалась в интервалах 1-4 лет [159], 2-5 лет [76], 5-8 лет [76], 6-8 лет [81], 4-8 лет [103]. Как свидетельствуют литературные данные и наши собственные наблюдения, заболеванию в основном подвержены зрелые и престарелые животные.

Существенный практический интерес представляет вопрос о предрасположенности определенных пород собак к Malassezia-инфекциям, т.к. многие авторы считают породу основным предрасполагающим фактором [137, 37]. В

целом заболевание регистрировалось среди представителей самых разнообразных пород - декоративных, служебных, охотничьих, бойцовых. Среди предрасполагающих особенностей в первую очередь выделяют строение ушной раковины - длинные висячие уши затрудняют вентиляцию слухового прохода, что создает благоприятные условия для развития Malassezia-отитов. Отсюда вытекает предрасположенность к данным заболеваниям таких пород, как бассет-хаунды, коккер-спаниели, пудели [77, 76]. В наших исследованиях отмечена высокая встречаемость Malassezia-отитов у бассет-хаундов, коккер- спаниелей, при этом у пуделей заболевание не зарегистрировано.

Нами продемонстрирована относительно высокая встречаемость заболевания у таких пород, как французский бульдог, английский бульдог, мопс, шар-пей, чау-чау. Все они относятся к брахицефалам - породам с укороченной мордой. Мы предполагаем, что эта анатомическая особенность строения черепа в определенной мере коррелирует с предрасположенностью животных к Malassezia-инфекциям. В доступных литературных источниках аналогичных наблюдений обнаружить не удалось.

В целом наши данные подтверждают взаимосвязь между породой и предрасположенностью собак к Malassezia-инфекциям. Однако вопрос, какие именно особенности породы играют роль предрасполагающего фактора, требует дальнейших исследований на большем фактическом материале. Также надо принимать во внимание распространенность и популярность тех или иных пород в конкретной местности.

В наших исследованиях была предпринята попытка проанализировать взаимосвязь между заболеваемостью Malassezia-отитами и условиями содержания и ухода за животными. Такие факторы как квартирное содержание, кормление готовыми кормами, недостаточный моцион, стрессы, избыточное кормление имели место в большинстве случаев. Очевидно, что воздействию указанных факторов подвергается большинство животных, содержащихся в городских условиях, и это не позволяет говорить об их предрасполагающей

роли применительно именно к Malassezia-инфекциям. Однако с другой стороны нельзя упускать из виду значимость этих факторов, оказывающих влияние на общее состояние организма, его резистентность в целом.

Среди сопутствующих заболеваний при Malassezia-oTHTax собак по нашим данным доминируют пищевые аллергии (63%) и иммунопатии, прежде всего атопические дерматиты (53%). Атопические заболевания указываются рядом авторов [77, 76] как наиболее распространенные первичные патологии при Malassezia -инфекциях. На значимость в этом аспекте пищевых аллергий и эндокринопатий указывает A. Patterson [137].

Результаты проведенных исследований согласуются с точкой зрения о предрасполагающей роли длительных курсов антибиотиков и гормональных препаратов в развитии Malassezia-инфекций [137]. Лишь у 17% собак, наблюдавшихся в ходе нашего исследования, не было выявлено каких-либо сопутствующих патологий.

Выделенные от больных животных штаммы М. pachydermatis проявляли схожие морфологические свойства, независимо от источника происхождения. Охарактеризовано строение колоний М. pachydermatis на различных питательных средах - сусло-агаре, среде Барфатини, среде Сабуро. Для детального изучения морфологических особенностей целесообразно продлевать сроки культивирования до 14 сут. (вместо 5-7). Практический интерес с точки зрения видовой идентификации представляет способность М. pachydermatis образовывать зоны преципитации вокруг колоний, что связано с липоли- тической активностью. К. Hammer et al. [92] наблюдали данное явление на среде Диксона. По нашим данным, на среде Барфатини липофильные дрожжи также образуют зоны преципитации вокруг колоний.

Физиологические свойства изученных штаммов М. pachydermatis соответствовали данным S. de Hoog et al., [23], J. Faergemann,[73]. Таким образом, изученные штаммы, составляющие популяцию М. pachydermatis в естественных условиях, в целом проявили однородность по изученным свойствам.

Вирулентные свойства М. pachydermatis при парентеральном заражении, насколько можно судить по доступной литературе, были изучены впервые. Летальность, патолого-анатомические изменения внутренних органов, выделение субкультур гриба от павших животных позволили сделать вывод о наличии у М. pachydermatis вирулентных свойств, позволяющих не только выжить в неблагоприятных биотопах организма-хозяина, но и преодолеть его защитные механизмы и осуществить инвазию в ткани и органы. Эти результаты расширяют представление о патогенном потенциале грибов рода Malassezia.

При накожном заражении собак культура М. pachydermatis также проявила вирулентные свойства. Учитывая, что заболели не все зараженные животные, можно заключить, что состояние (статус) макроорганизма определяет восприимчивость к Malassezia-инфекции. Полученные результаты согласуются с данными R. Bond et al. [41], в аналогичном опыте которых также заболели не все зараженные животные. Однако эти авторы апплицировали культуру М. pachydermatis ежедневно в течение 7 сут., а вызванные поражения характеризовались незначительной эритемой и образованием папул. В нашем эксперименте культура наносилась однократно, а поражения носили характер выраженного сквамозного дерматита. И в том, и в другом случае экспериментальный Malassezia-дерматит быстро разрешался самовыздоровлением. Можно заключить, что защитные механизмы кожи здоровых животных быстро нейтрализуют негативное воздействие М. pachydermatis, а для развития хронического дерматита, имеющего место в естественных условиях, определяющим фактором является снижение резистентности макроорганизма.

При поддержании культур М. pachydermatis посредством пересевов на агаризованных средах целесообразно использовать среду Барфатини при интервалах между пересевами до 30 сут. Аналогичные данные были получены М. Crespo et al. [57] при использовании среды Сабуро с добавлением оливко-

вого масла (аналог среды Барфатини). Уже через 60 сут. жизнеспособность сохраняли только 15% культур М. pachydermatis, а на 4-й мес. хранения все культуры утрачивали жизнеспособность.

Хранение культур в глицерине при 5-8°С обеспечивало их сохранность в течение 3 мес. (срок наблюдения). По данным М. Girao et al. [94], культуры М. pachydermatis на среде Диксона под слоем глицерина сохраняли жизнеспособность в течение 9 мес.

Показано, что для длительного хранения культур М. pachydermatis может быть использован метод лиофилизации. Однако жизнеспособность М. pachydermatis после лиофилизации снижается на 27-31%, а после 3-летнего хранения содержание жизнеспособных грибных клеток составляет лишь 2- 5%. Сопоставимые данные были получены М. Crespo et al. [57]. Концентрация жизнеспособных клеток М. pachydermatis непосредственно после лиофилизации составила 43% от исходной, а после 18-месячного хранения - лишь 8%. Можно заключить, что метод лиофилизации перспективен для длительного хранения М. pachydermatis, однако требует существенной оптимизации для обеспечения большей жизнеспособности гриба. Очевидно, существенную роль при данном методе играет подбор оптимальной защитной среды.