1.5.2. Цитологические и культуральные методы диагностики Malassezia-инфекций

Для получения достоверных результатов как при цитологическом, так и при культуральном исследовании, существенную роль играет способ отбора патологического материала. Известно несколько процедур, используемых для этих целей как в медицинской, так и в ветеринарной практике.

Метод прямого мазка-отпечатка очевидно является наиболее простым и доступным.

Метод с использованием полосок полимерной пленки («пленочный метод») был предложен впервые J. Wilkler в 1988 году. При этом методе полоску пленки площадью 1 см2 дважды прикладывают к пораженному участку, после чего окрашивают для цитологического исследования, или помещают на поверхность питательной среды для культурального анализа. D. Morris [129] для отбра проб с гладкой кожи использовали полоски целлофана (5x2 см), которые прикладывали к поверхности кожи 2 раза, а затем помещали на поверхность среды Сабуро в каплю оливкового масла. Модификацией данного метода является метод с использованием липкой ленты (скотча). Данный метод применялся в частности A. Nell [96], D. Preziozi [146], М. Pechere [138].

Метод с использованием контактных чашек («бакпечаток») используется в исследованиях R. Bond [34], A. Nell [96], A. Gupta [89]. Небольшие пластиковые чашки, заполненные до краев плотной питательной средой, прикладывают на определенное время к очагу поражения, после чего закрывают крышкой и инкубируют. Данный метод позволяет провести количественный учет численности популяции дрожжей на определенной площади кожи. Помимо удобства в применении, он также является перспективным с точки зрения стандартизации диагностических процедур, т.к. «бакпечатки» выпускаются промышленным способом.

Метод смыва существует в нескольких вариациях, в частности смыв- соскоб (по Williamson-Kligman) и смыв-мазок.

площади, широко распространен в медицинской микологии, однако малоприменим в ветеринарной практике.

R. Bond [34] для смыва использовал различные составы - Тритон X- 100, Твин-40, Твин-80, и пришли к выводу, что они одинаково подходят для получения суспензии дрожжевых клеток, однако жизнеспособность Malassezia spp. в суспензии существенно снижается уже через два часа. Чувствительность метода смыва была сопоставима с методом контактных чашек.

Отбор материала ватным тампоном-зондом является одним из наиболее распространенных методов отбора материала для культуральных и цитологических исследований [56, 20,65]. Основное его преимущество - возможность отбора проб из труднодоступных участков тела животного - межпальцевых складок, слухового канала; шерстный покров не препятствует отбору. Некоторые авторы при отборе материала из слухового канала используют специальный стерильный конус, через который вводят тампон-зонд в слуховой канал, что позволяет снизить контаминацию пробы микроорганизмами с ушной раковины [76].

При использовании большинства техник отбора патологического материала пробы в дальнейшем могут быть использованы как для цитологического, так и для культурального исследования. Исключение составляют метод прямого мазка-отпечатка, который используется только при цитологических исследованиях, и метод контактных чашек, применимый только для культу- ральной диагностики.

Среди авторов не существует единого мнения о предпочтительности какого-либо из перечисленных методов отбора патологического материала.

ность проявил культуральный метод с использованием скотча. Цитологическое исследование оказалось менее чувствительным, причем метод отбора материала для исследования не оказывал существенного влияния на результаты.

По мнению N. McEwan [124] оптимальными методами отбора материала являются метод с использованием липкой ленты и метод вычесывания шерсти зубной щеткой по МакКензи (MacKenzie).

A. Omodo-Eluk [135] сообщает, что при отборе материала ватным тампоном дрожжи рода Malassezia были обнаружены на коже у 53% собак при культуральном исследовании и у 32% - при цитологическом. При отборе материала с помощью липкой ленты эти показатели составили 80% и 43% соответственно. Автор отмечают преимущества отбора материала с помощью скотча и культурального метода исследования по сравнению с цитологическим.

Пробы, отобранные для культурального исследования, необходимо доставлять в лабораторию в максимально сжатые сроки. F. Bernardo [29] делал высевы материала с ватных тампонов-зондов не позднее 2 часов после отбора.

Резюмируя вышеизложенное, отметим положительные и отрицательные стороны различных методов отбора патматериала для диагностических исследований на наличие Malassezia-mi§Qmw.Vi. Кожный соскоб связан с травмированием кожи и не позволяет точно оценить плотность популяции Malassezia spp. в очаге поражения. Метод смыва наоборот пригоден для оценки плотности популяции на определенной площади кожного покрова, однако он требует выстригания шерсти и не пригоден для труднодоступных участков тела. Аналогичные свойства у метода с использованием пленки (скотча). Метод контактных чашек (бакпечаток) отличается практичностью, удобством в применении и возможностью количественного учета дрожжей, однако тоже не применим для труднодоступных участков тела.

Очевидно, наибольшей универсальностью обладает метод с использованием ватных тампонов-зондов.

Вопрос условий транспортировки патматериала для последующей куль- туральной диагностики к сожалению весьма поверхностно освещен в доступной литературе. Исходя из общемикологической практики, патматериал (за исключением волос и кожных чешуек) должен быть исследован в течение часа после доставки или через 3 часа при хранении в холодильнике при +4°С [1]. Однако, в повседневой лабораторной парктике не всегда удется соблюсти эти условия.

В жидких образцах, полученных методом смыва с применением различных детергентов, жизнеспособность Malassezia spp. резко снижается уже через 2-3 часа. Сухие образцы (на пленке, на ватных тампонах-зондах, соскобы) также должны исследоваться как можно скорее, т.к. низкая влажность губительна для дрожжевых грибов. Использование для транспортировки жидких питательных сред напротив создает предпосылки для размножения как дрожжей, так и сопутствующей бактериальной и грибной микрофлоры. Таким образом, эти способы не обеспечивают длительную сохранность в материале грибов рода Malassezia, что ограничивает их использование в повседневной ветеринарной практике.

В подавляющем большинстве изученных нами литературных источников не упоминается об использовании микробиологических транспортных сред, которые бы обеспечивали длительную сохранность Malassezia spp. в образце патологического материала. G. Fernandez [76] для транспортировки образцов успешно применял коммерческую транспортную систему BBL Cul-

ture Swabtm Transport media, однако авторы не расшифровывают состав транспортной среды, а также сроки, в течение которых клетки Malassezia spp. оставались жизнеспособными.

Приведенные данные указывают на актуальность дальнейших изысканий практичных и доступных методов отбора и транспортировки патологического материала при диагностике Мз/огсегш-инфекций.

Цитологическое исследование при диагностике Ма/о^еяш-инфекций обычно включает фиксацию препарата над пламенем, его окраску и микроскопию как в сухой, так и в иммерсионной системе микроскопа.

Для обнаружения клеток Malassezia может быть использовано несколько методов окраски. A.

Окраска метиленовым синим и окраска чернилами Паркера (Parker ink) также используется для детекции грибов рода Malassezia. По данным L. Xiong [171], частота обнаружения Malassezia spp. при использовании этих методов существенно не отличается и составляет 96% при окраске метиленовым синим и 94% при окраске чернилами Паркера. Однако окраска метиленовым синим, в отличии от окраски чернилами, достаточно чувствительна и для обнаружения других дрожжевых грибов, в частности Candida spp.

М. Crespo [56] в своих исследованиях применяли окраску по Грамму. А. Padilha-Goncalves [136] успешно использовал окраску лактофеноловым синим.

Большинство зарубежных авторов используют окраску Diff-Quik, являющуюся модифицированным методом Райта (Wright), и выпускаемую промышленным способом (Dade Behring, Deerfield, IL, USA; Baxter Diagnos-

tics AG, Dudingen, Switzerland). При этом способе клетки гриба окрашиваются в сине-фиолетовый, реже в красно-розовый цвет. По форме клетки как правило овальные, или в форме «отпечатка стопы» или «земляного ореха». Еще одним коммерческим красителем, применяемым для выявления Malassezia, является Hemacolor ® [53].

L. Cornegliani [53] рекомендует окраску кристалл-виолетом. По данным авторов, при этом методе дрожжевые клетки окрашиваются интенсивно и практически моментально, а чувствительность метода сопоставима с таковой при использовании Diff-Quik.

Микроскопию проводят при увеличении хЮОО в иммерсионной системе или в сухой системе при увеличении х400.

Для оценки численности популяции грибов рода Malassezia не существует стандартных общепринятых показателей. Так, D.

По мнению F. Rausch [150], диагностическое значение имеет только обнаружение более 10 дрожжевых клеток в поле зрения при х400, что соответствует примерно 4 клеткам при микроскопии с иммерсией. Аналогичный критерий использовал G. Fernandes [76]. По данным этого автора, у 33,3% здоровых и 30,2% больных отитом собак клетки Malassezia spp. не обнаруживались; у 40,0% здоровых и 28,3% больных собак содержание клеток не превышало 4 в поле зрения при микроскопии с иммерсией, и у 26,6% здоровых и 41,5% больных животных обнаружено более 4 клеток.

С. Reme сообщает, что в слуховом канале здоровых собак количество клеток Malassezia при микроскопии с иммерсией только в 4% превышало 4 клетки в поле зрения. У 50% животных этот показатель составлял 01,-1,3 клетки, у 28% дрожжи не обнаруживались, у 18% животных обнаруживали 1,5-3,5 клеток. На основании полученных результатов автор предполагает,

что в норме обнаружение клеток Malassezia не должно превышать 3,5 клетки в поле зрения при микроскопии с иммерсией (хЮОО) или 10 клеток при увеличении х400.

Foster А. [77] считает популяцию дрожжей повышенной, если наблюдается 5 и более клеток в поле зрения при х400. Такого же мнения придерживаются J. Angus [17], J. Beck et al. [25].

D. Morris et al. [129] считают максимально допустимым количеством 1 клетку в мазках с кожи и 5 клеток в мазках из ушного канала в одном поле зрения при микроскопии с иммерсией.

М. Crespo et al. [56] сообщают, что количество дрожжевых клеток в пробах от собак, больных отитом, при увеличении 400х составляло в 43,8% менее 10 клеток в поле зрения; в 24,6%) - более 10 клеток.

P. Ginel et al. [22] приводят данные о корреляции интенсивности клинических признаков отита с численностью популяции дрожжей в очаге поражения. У больных собак обнаруживали 5 и более дрожжевых клеток в поле зрения при х400, у больных кошек - 12 и более клеток. При этом только у 2-х из 37 здоровых собак было обнаружено более 5 клеток в поле зрения. У 23 из 32 здоровых кошек клетки Malassezia spp. обнаружить не удалось.

J. Beck et al. [25] у собак с гнойным отитом обнаруживали в среднем 12 клеток в поле зрения при х400, у собак с эритематозным и эруминозным отитом - 13 клеток, у собак с церуминозным отитом - 9, у собак к эритематозным отитом - 2 клетки.

Таким образом, среди авторов нет единого мнения, какое содержание клеток Malassezia на кожном покрове считать нормальным или повышенным. Кроме того, при цитологическом исследовании содержание дрожжевых клеток в разных полях зрения в одном и том же препарате может существенно колебаться, что снижает репрезентативность получаемых данных.

Гистологические методы диагностики Мя/а&уегш-инфекций в клинической практике используются существенно реже. Как правило, при изготовле-

нии препарата большая часть дрожжевых клеток теряется, что искажает результаты исследования. D. Pin [139] для окрашивания гистосрезов использовал гематоксилин-эозин и сафранин, что позволяло обнаружить почкующиеся дрожжевые клетки.

По сравнению с цитологическими, культуральные методы позволяют более точно оценить численность популяции дрожжей в очаге поражения, однако нет единого мнения, какую численность популяции считать патологической. К сожалению, сравнительной оценке плотности популяции Malassezia spp. у здоровых и больных животных культуральными методами посвящены единичные публикации. Так, С. Cafarcia et al. [45] сообщают, что у собак, больных отитом, плотность популяции Malassezia spp. в слуховом канале составляла 66,0 КОЕ в образце, у кошек — 59,6 КОЕ. По данным R. Bond [39], на коже здоровых собак в области паха и подкрыльцовой ямки

о

плотность популяции Malassezia spp. составляет менее 1 КОЕ на см .

Мнения различных авторов расходятся в оценке чувствительности и специфичности цитологических и культуральных методов. D. Morris [128] считает цитологический метод диагностики наиболее практичным и достаточно информативным для повседневной ветеринарной практики. По данным М. Crespo et al. [56], частота обнаружения грибов рода Malassezia была идентичной при цитологическом и культуральном анализе, и составила в обеих случаях 68,4%. В другом исследовании частота обнаружения Malassezia-spp. культуральным методом составила 21,2%, цитологическим — 15,1% [58].

По данным A. Kumar et al. [103], частота обнаружения Malassezia spp. у здоровых собак составила 39,4% при цитологическом анализе и 45,4% - при культуральном. Однако у больных животных дрожжи обнаруживались с одинаковой частотой (82,1%) и при цитологическом, и при культуральном методе исследования.

Bensignor Е. et al. [52] при сравнительном изучении цитологического метода с использованием липкой ленты и культурального метода контактных

чашек со средой Диксона пришли к выводу, что чувствительность культурального метода существенно выше, однако для оценки плотности популяции Malassezia spp. лучше подходит цитологический метод.

С. Cafarchia et al. [46] сообщают о бесспорном преимуществе культурального метода диагностики и предлагают использовать его в качестве «золотого стандарта». По представленным данным, цитологический метод проявил высокую специфичность (95%), однако крайне низкую чувствительность (лишь 30%).

J. Angus [17] считает наиболее достоверным комбинированное применение цитологического и культурального исследования.

Резюмируя сведения о различных диагностических методах при Malassezia-иифвкцшх можно сделать вывод, что большинством авторов отдается предпочтение культуральным методам диагностики. Они несколько более трудоемкие, нежели цитологические, однако обладают более высокой чувствительностью, позволяют провести видовую идентификацию изолята и определить его чувствительность к антифунгальным препаратам. Последнее обстоятельство имеет большое практическое значение, т.к. чувствительность грибов рода Malassezia к различным антифунгальным препаратам может существенно варьировать [88].