ТЕРМОДИНАМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТОЯНИЯПОЧВЕННОЙ ВЛАГИ (ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ,АКТИВНОСТЬ ВОДЫ)

Условия увлажнения в почве обычно характеризовали ее влажностью, выраженной в процентах от веса. Однако эта величина недостаточно точно определяет степень доступности воды для организмов.

ная. В глинистой почве она меньше, так как вода будет связана с огромной поверхностью глинистых частиц, а в песчаной — больше. Возможность объективно оценить состояние воды в почве и ее влияние на жизнедеятельность микроорганизмов дает определение потенциала влаги (активности воды), так как в этом случае состояние воды в почве, растениях, микроорганизмах, атмосфере, снегу и во льду характеризуется при помощи единой, физически строго определенной величины — термодинамического потенциала. Этот показатель характеризует степень связанности и термодинамической подвижности воды в системе, причем он не зависит от того, связана ли вода с поверхностью почвенных частиц, ионов солей, макромолекул или кристаллов льда.

В микробиологии наиболее часто используется термин активность воды (aw), который характеризует степень связанности ее молекул и тем самым степень доступности для микроорганизмов. Активность воды соответствует проценту относительной влажности воздуха, о которой ежедневно сообщается в сводках погоды. Только эта величина выражена не в процентах, а в долях единицы. Активность свободной воды равна единице. При взаимодействии воды с твердыми поверхностями, катионами и анионами, молекулами мономеров и полимеров, т.е. любыми гидрофильными группировками, активность воды становится меньше единицы. Активность воды определяется по формуле

где Р — давление водяного пара в исследуемой системе, Р0 — давление пара над чистой водой, ОВ — относительная влажность воздуха в системе, Я, — число молей растворителя, Я2 — число молей растворенного вещества.

Состояние воды в системе часто определяется потенциалом влаги. Он характеризуется давлением, которое нужно приложить, чтобы при данных условиях началось удаление молекул воды из системы. Иначе можно сказать, что потенциал влаги измеряется количеством работы, которая должна быть затрачена для извлечения воды:

P=dA_

dV'

где А — работа, V— объем.

Потенциал чистой воды равен нулю. По отношению к чистой воде все растворы имеют отрицательные потенциалы, которые выражаются в отрицательных атмосферах или мегапаскалях (МПа) (1 атм = 0,1 МПа).

Сопоставление различных величин, выражающих термодинамическое состояние воды, представлено в табл. 3.

Водный потенциал часто выражается в барах (1 бар= 106дин/см2 = = 0,987 атм). Его также можно выразить через активность воды (табл. 3).

Таблица 3

Относительная влажность воздуха, активность воды и потенциал влаги при 20 °С

где Wa — молекулярный вес воды, R— газовая постоянная, Т— абсолютная температура.

Потенциал воды может быть матричным или осмотическим. Матричное изменение водного потенциала обусловлено адсорбцией молекул воды на поверхности почвенных частиц. Осмотическое изменение водного потенциала происходит в растворе в результате взаимодействия молекул воды с растворенными веществами.

Различные микроорганизмы имеют разные границы активности воды, в которых возможно их развитие (табл. 4). Наиболее ксерофильными (ксеротолерантными) являются некоторые грибы. Они могут развиваться при aw-0,60. Во многих работах утверждается, что те или иные микроорганизмы могут развиваться при awlt; 0,50, но пока все эти данные недостоверны.

Способность грибов развиваться при низких значениях активности воды, возможно, связана с их способностью «запирать» свободную воду в определенных участках клеток, ограниченных липидными мембранами. Этой способностью обладают эукари- отные клетки, а прокариоты ее лишены. Следует отметить, что ряд микроорганизмов не развивается не только при низких активностях воды, но и при слишком высоких (табл. 4).

Таблица 4

Величины активности воды, лимитирующие рост микробов

Примечание. В скобках — оптимальные значения а„\ 1 не растет при lt;з„„ превышающих 0,97.

По имеющимся сведениям бактерии являются гигрофилами, но исключение составляют по крайней мере галофилы, для развития которых необходима низкая активность воды, и нижний предел их развития находится в области активности воды 0,75-0,85.

Раньше выделяли и рассматривали следующие формы воды в почве: 1) гигроскопическую; 2) пленочную; 3) капиллярную; 4) гравитационную. В настоящее время показано, что выделение этих форм воды не вполне оправданно, так как границы между разными формами весьма условны. Однако с позиций эколога-микробиолога полезно представить себе конкретное пространственное расположение клеток микроорганизмов и определенных форм воды (рис. 101, 102).

Гигроскопическая вода удерживается на поверхности почвенных частиц со сравнительно большой силой, которой достаточно, чтобы удержать движущиеся с большой энергией молекулы воды, находящиеся в газообразном состоянии. Почва насыщается до максимальной гигроскопичности, когда относительная влажность воздуха равна 98% (aw = 0,98). Часто ошибочно считают, что насыщение до максимальной гигроскопичности происходит

при относительной влажности 100%. Гигроскопическая вода образует очень тонкий слой, который, вероятно, составляет сотые доли микрометра, т.е. гораздо тоньше, чем даже самые мелкие

клетки бактерий. Обычно он в сотни раз тоньше клетки. Пленка гигроскопической воды покрывает не только

Рис.

пленках и капиллярах разной

толщины:

I— пленка и капилляры очень тонкие, клетки прижаты к поверхности; 2 — пленки и капилляры значительно толще клеток, могут встречаться и свободные и адгезированные клетки; 3— пленки и капилляры во много раз толще клеток, возможно свободное передвижение клеток

почвенные частицы, но и гидрофильные участки клеток микроорганизмов (см. рис. 101). Напомним, что ряд биополимеров способен очень сильно гидратироваться, например многие белки и полисахариды адсорбируют до 30-100% воды от своего веса. Многие микроорганизмы развиваются при содержании воды гораздо меньшем, чем максимальная гигроскопическая. Их следует рассматривать как развивающиеся «на суше, сухопутные». Неправильно относить все микроорганизмы к гидробионтам, как это часто делается в экологии, когда утверждают, что микробы развиваются в объеме воды вне зависимости от того, где они находятся — в море или в почве. Можно разделить сухопутный и водный способы развития микроорганизмов в почве в зависимости от того, идет ли их развитие в объеме жидкости или в тонкой пленке. Ксерофиты — это «сухопутные» микроорганизмы, гигрофилы — водные. Размножение, морфология и метаболизм микроорганизмов, развивающихся при резком дефиците влаги, весьма специфичны.

При очень тонких пленках и низкой активности воды можно предположить возможность развития микроорганизмов за счет метаболической воды, которая получается в результате окисления органического вещества внутри клеток: С6Н!206 + 602 = 6С02 + + 6Н20. Исходя из уравнения можно рассчитать, что на 1 кг использованного сахара образуется 600 г воды.

При влажности воздуха больше 94% начинает формироваться пленочная вода, причем пленки могут быть значительно толще, чем при увлажнении до максимальной гигроскопической. Они могут быть и тоньше микробных клеток, и толще их (см. рис. 101, 102) — от долей микрометра до десятка или нескольких десятков микрометров. Условия развития микроорганизмов в пленках разной толщины отличаются, что обусловлено скоростью диффузии газов к клеткам, спецификой условий диффузии других веществ и т.д. В почве обычно одновременно имеются пленки различной толщины.

Если две пленки соединяются вместе благодаря наличию двух близко расположенных поверхностей, то образуется капилляр, заполненный так называемой капиллярной водой. В каждой почве капилляры не одинаковы по толщине, длине и конфигурации. Они могут быть и тоньше самой мелкой микробной клетки и иметь толщину в десятки и сотни микрометров. Развитие микроорганизмов в толстых и тонких капиллярах специфично. Об этом, в частности, говорят опыты по изучению роста некоторых аэробных, анаэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов в стеклянных капиллярах. Чем тоньше капилляр, тем медленнее размножаются микроорганизмы, причем это положение относится к аэробным и к анаэробным микробам. Более крупные микроорганизмы (грибы) нуждаются для хорошего развития в наличии более толстых капилляров, чем более мелкие микроорганизмы (бактерии). В тонких капиллярах и пленках клетки мельчают. Возможно, одной из причин мелких размеров почвенных микроорганизмов по сравнению с водными формами и с формами, развивающимися на питательных лабораторных средах, является их развитие в тонких капиллярах и пленках. Иногда клетки принимают форму капилляра, в котором они развиваются. В тонких капиллярах клетки лизируются, что было хорошо изучено для клеток, заключенных в полиакриламидный гель (ПЛАГ). В настоящее время трудно однозначно решить вопрос о причинах плохого развития микроорганизмов в тонких пленках и капиллярах. Вероятно, основную роль играет специфика диффузии веществ. Для проявления активности микробов в очень тонких пленках и капиллярах первостепенное влияние оказывает изменение активности воды. Однако для более толстых пленок и капилляров наибольшее значение имеет скорость подтока к клеткам питательных веществ и оттока вредных метаболитов.

Гравитационная вода — это та часть воды, которая свободно передвигается в почве под действием силы тяжести. Это временная форма воды в почве, которая появляется после дождя или полива, но быстро исчезает и имеет большее значение для транспорта веществ, чем для развития микроорганизмов. Установлено, что бурное развитие микроорганизмов в почве после выпадения дождя связано не только с появлением доступной влаги, но и с тем, что вода несет растворимые органические вещества.

Следует четко дифференцировать: 1) выживаемость в условиях низкой активности воды, 2) специфику метаболизма в этих условиях.

Среда обитания микроорганизмов, как уже отмечалось, может быть прерывистой в пространстве и во времени. В этом отношении, очевидно, во всех почвах, за исключением неоттаивающих постоянно мерзлотных, имеются хотя бы кратковременные периоды с обильным увлажнением, и микробы даже в пустыне могут после дождя развиваться в условиях высокой активности воды. Такие периоды в ряде засушливых зон бывают очень редко, и большую часть времени микроорганизмы находятся в условиях низкой влажности. При этом они находятся в состоянии анабиоза или замедленного метаболизма. К почвам с постоянно низкой активностью воды относятся солончаки, где могут развиваться только гадофилы.

Активность воды в системе (почве) зависит от наличия ряда веществ, в том числе и растворимых солей. В солевых растворах активность воды (потенциал влаги) резко падает. В связи с этим следует отметить, что понятия ксерофилии и осмофилии по существу имеют один и тот же смысл. В солевых растворах микробы развиваются как бы в условиях засухи, так как получить воду для клетки становится трудно. В солевых растворах на развитие микроорганизмов влияют два фактора: 1) низкая активность воды, токсичность высоких концентраций определенных катионов и анионов для клетки. Поэтому развитие микроорганизмов в солевых растворах даже при одинаковой активности воды будет зависеть от природы соли.

На земле существует много разнообразных засоленных почв — солончаков. Разные типы солончаков могут содержать очень высокие концентрации сульфатов, хлоридов, нитратов и карбонатов. В некоторых солончаках должны развиваться только экстремально галофильные микроорганизмы, которые имеют особое строение и относятся к архебактериям. Однако систематического изучения галофилов из засоленных почв до настоящего времени не проводилось, хотя солончаки, по крайней мере теоретически, представляются более благодатным объектом для выделения этих форм по сравнению с засоленными природными водами, из которых они обычно выделяются.

Штаммы одного вида гриба, выделенные из почв гумидной и аридной зон, отличаются по способности развиваться при низкой активности воды.

Необходимо кратко рассмотреть вопрос об устойчивости почвенных микроорганизмов к высушиванию. Устойчивость к высушиванию не связана непосредственно со способностью развиваться при низкой влажности.

В природе есть почвы, которые никогда не подвергаются полному высыханию (почвы под лесами, болотами, почвы тундры), хотя активность воды в них зимой в период промерзания низкая. Есть почвы, которые подвергаются длительному и сильному иссушению (почвы пустыни и полупустыни). Распахиваемые почвы подвергаются сильному иссушению по крайней мере с поверхности — это новое антропогенное воздействие для этих почв, которому они раньше не подвергались.

Известно, что после высушивания почвенных образцов до воздушно-сухого состояния определяемое в них количество бактерий уменьшается в 5-10 раз. Резко уменьшается и количество актиномицетов и грибов, но обычно не так, как бактерий. В высушенных образцах почв меняется качественный состав микроорганизмов. Считается, что некоторые микроорганизмы, например некоторые неспороносные палочки, полностью погибают. Однако последнее утверждение нельзя считать доказанным. Установлено, что их количество резко снижается и их не удается учесть, но в большинстве случаев, если провести «оживление почвы», т.е. почву увлажнить и инкубировать в течение некоторого времени, то исчезнувшие формы можно обнаружить, особенно, если выбрать благоприятную для их выделения стадию микробной сукцессии в почве.

Процент гибели микроорганизмов в высушенных образцах оказывается не таким высоким, как считалось ранее. Большая часть клеток при высушивании прочно адгезируется на почвенных частицах, в почве образуются новые агрегаты, и клетки просто перестают учитываться обычными методами посева. Однако применение ультразвуковой или другой предварительной обработки почвы перед проведением микробиологического анализа, направленной на дезагрегацию почвы и десорбцию микроорганизмов, позволяет найти часть этих исчезнувших клеток (иногда до 90%), которые считались погибшими. Фактическая гибель даже в количественном отношении, не говоря о качественном составе, оказывается не такой большой, как это ранее предполагалось. При хранении воздушно-сухих образцов на протяжении первых двух недель происходит значительное сокращение определяемого методом посева количества микроорганизмов, а затем оно замедляется. Первоначальное падение больше связано с адсорбцией клеток, чем с их действительной гибелью. Существует много данных, подтверждающих, что воздушно-сухая почва является очень хорошей средой для хранения внесенных культур микроорганизмов и тем более для собственно почвенных.

Причины хорошего сохранения микроорганизмов в воздушно-сухой почве не совсем ясны, однако можно привести следующие гипотезы. В почве микроорганизмы попадают в многочисленные микрозоны, и хотя бы часть из них оказывается благоприятной для сохранения микробов. В почве поддерживается сравнительно постоянный уровень относительной влажности (активности воды), что также может благоприятствовать сохранению микроорганизмов. Известно, что их выживанию, правда, обычно в меньшей степени, чем почва, способствует ряд адсорбентов (глины, уголь, мел и др.). Предполагается, что собственно адсорбция клеток на твердой поверхности, обволакивание клеток мелкими органоминеральными частицами, заключение их в тонкие капилляры и попадание в закрытые пространства, где затруднен обмен с окружающей средой, будут способствовать выживанию клеток.

В условия засухи микроорганизмы попадают и зимой при отрицательных температурах. При зимней засухе отрицательное действие на клетки может оказывать не только недостаток воды, но еще и тот фактор, что образующиеся кристаллики льда могут механически разрушать клетки. Однако при морозе создаются отчасти и более благоприятные условия для выживания, так как при низких температурах крайне замедленны все биохимические процессы. Поразительна длительность сохранения бактерий в замерзших почвах (Арктика, Антарктика). При высевах из постоянно мерзлых почв (зона вечной мерзлоты) обнаружилось, что на 1 г погребенной почвы, пролежавшей при температуре - 10-30 °С в течение 1-10 млн лет, обнаруживается 100 тыс. клеток живых бактерий. Если учесть, что в современных тундровых почвах содержится 1 млн клеток бактерий на 1 г, также обнаруживаемых методом посева, то можно допустить, что за 1-10 млн лет число жизнеспособных клеток уменьшилось всего в 10 раз и клетки в погребенных почвах могут сохраняться еще очень долго.

Эукариотные микроорганизмы (грибы, дрожжи, водоросли) также были обнаружены в слоях этого возраста. Можно с уверенностью утверждать, что это эндогенная микрофлора, а не случайное загрязнение, так как обнаруживаются целые сообщества, а случайное загрязнение могло быть вызвано одним-тремя видами. Обнаружение высокой заселенности микроорганизмами вечномерзлых пород дает веские основания для астробиологической концепции поиска жизни на планетах криогенного типа, в первую очередь на Марсе и его спутниках. Методологический опыт микробиологических и биохимических (ДНК и активные ферменты сохраняются еще лучше, чем микроорганизмы) исследований земной мерзлоты необходим для решения такого рода задач, а они уже начаты с запуском космических кораблей на Марс.

Однако степень увлажнения почвы влияет на развитие микроорганизмов не только в связи со степенью доступности воды, но и в связи с тем, что количество воды во многом определяет газовый режим почв и отдельных микрозон. Диапазон для максимального роста почвенных аэробных микроорганизмов очень узок и, с одной стороны, лимитируется активностью воды, а с другой — недостатком кислорода.

Касаясь способов выражения доступности воды для микроорганизмов, нужно отметить, что в противоположность принятому в микробиологии показателю активности воды лучше пользоваться показателем потенциала влаги, как это делают физиологи растений, так как изменения этой величины измеряются целыми числами, а не дробями, и более наглядны.