КРУГОВОРОТ АЗОТА

Большие запасы азота на нашей планете представлены его восстановленными и окисленными газообразными формами (N2, NH3gt;. N20, NO, NO2), которые входят в состав атмосферы и содержатся в почвенном воздухе.

В почве иммобилизовано азота в три раза больше, чем его содержится в биомассе растений и животных. И при этом азот в почве часто бывает в первом минимуме, так как он находится в недоступной для растений форме. Основная масса почвенного азота заключена

в перегнойных соединениях, которые минерализуются очень медленно. Это вызывает необходимость применения азотных удобрений, производство которых ежегодно возрастает. Внесение в почву 1, кг/га азота в форме минерального удобрения обеспечивает в среднем повышение урожая на 10 кг по зерну. Мировое сельское хозяйство ежегодно выносит с урожаем ПО млн. т. азота, а вносит в виде удобрений 48 млн. т (данные 1976 г.). Если учесть, что коэффициент использования минеральных удобрений равен примерно 50%, то потребности в азоте покрываются лишь на 20—25% из расчета по урожаю. Остальная часть азота урожая берется из почвенных запасов и за счет его биологической фиксации. Дальнейшее повышение продуктивности растений будет зависеть от увеличения производства минеральных удобрений, рационального применения навоза и других азотсодержащих отбросов, а также от эффективного использования «биологического» (фиксированного микроорганизмами) азота.

Круговорот азота в природе разбивается на несколько основных звеньев, в которых главными агентами выступают микроорганизмы (рис. 52). В этом круговороте участвует как молекулярный азот, так .и его разнообразные соединения — минеральные и органические.

Азотфиксация — главное звено в цикле азота, потому что именно этот процесс лимитирует все остальные звенья превращения азота. Фиксация азота микроорганизмами — планетарный процесс, который сопряжен с фотосинтезом растений и равен ему по масштабам и значению. В ходе МБП было установлено, что общая продукция микробной фиксации азота составляет от 270 до 330 млн. т/год. Из них 160—170 млн. т/год дает суша и 70—160 млн. т/год — океан. Для сравнения можно указать, что небиологические процессы связывания азота, идущие в атмосфере (газовые разряды) или в области деятельности человека (работа двигателей внутреннего сгорания), дают всего 0,5% фиксированного азота. Химический способ получения азотных удобрений по методу Габера—Боша, заключающийся в восстановлении молекулярного азота водородом при температуре 400—500° и давлении в несколько сотен атмосфер, дает лишь около 5% и требует огромных затрат энергии. В современный период разрабатываются новые способы синтеза азотсодержащих соединений при помощи металлорганических катализаторов в мягких условиях: при нормальном атмосферном давлении и комнатной температуре.

Молекулярный азот — инертное соединение, так как два атома в нем имеют тройную прочную связь. Она состоит из одной а-компо- ненты и двух я-компонент. Для того чтобы разорвать первую связь (я-компоненту), требуется 125 кал на одну грамм-молекулу азота. Следующие две связи в молекуле азота рвутся уже гораздо легче (рис. 53). Фиксация азота представляет собой процесс его восстановления или присоединения электронов. Он легче идет в присутствии соединений переходных металлов, в качестве которых можно использовать соли титана, ванадия, хрома, молибдена, вольфрама. Восстановителями могут служить металлорганические соединения, гидриды металлов и т. д.

Способность к биологическому связыванию молекулярного азота присуща только прокариотным микроорганизмам.

Азотфиксирующие микроорганизмы (диазотрофы) связывают молекулярный азот при атмосферном давлении и нормальной для жизни температуре.

Образование нитрогеназы связано с наличием в клетке так называемой nif-плазмиды, регулирующей синтез этого белка. Передача nif-плазмиды от одного вида бактерий к другому может привести к появлению способности к азотфиксации у новых микроорганизмов. На этом основаны эксперименты в области генной инженерии.

В настоящее время признается, что очень многие бактерии, включая синезеленые и актиномицеты, способны в той или иной мере фиксировать молекулярный азот. Азотфиксаторы известны среди анаэробных клостридиев, сульфатредуцирующих бактерий, энтеробактерий, фотосинтезирующих анаэробов, спирилл, псевдомонад, актиномицетов и других групп прокариот. Многочисленные указания на фиксацию-

азота эукариотными организмами — дрожжами, грибами, зеленым» водорослями и клетками высших животных — при проверках не подтверждаются, что соответствует современным представлениям об уникальности этого процесса, характерного только для прокариотической организации клетки.

Для осуществления азотфиксации необходимо большое количества энергии, поэтому процесс активно идет в тех случаях, когда микроорганизмы находятся в тесном контакте с растением, которое служит источником энергетического материала. Бактерии-диазотрофы либа живут на поверхности разных частей растения в филлоплане (на листьях) и в ризоплане (на корнях)', либо внедряются в его ткани, образуя клубеньки (на корнях) и узелки (на листьях). Процессы связывания азота клубеньковыми бактериями называют симбиотической азотфиксацией, а бактериями на поверхности растений — ассоциативной.

Клубен.ьковые бактерии образуют симбиотическое сообщество с бобовыми растениями. Название этих бактерий связано с тем, что при внедрении их в корень происходит разрастание ткани с образованием опухолевидных клубеньков. Известно около 13 000 видов бобовых, из них у 1300 (10%) найдены клубеньки.

Первое описание наличия бактерий в клубеньках принадлежит русскому биологу М. С. Воронину. В 1866 г. он впервые тщательно исследовал срезы клубеньков на корнях люпина и обнаружил в клетках ткани многочисленных бактерий. Его рисунки не оставляют сомнения,,

что он видел именно клубеньковые бактерии. Чистые культуры этих бактерий впервые получил М. Бсйеринк в 1888 г. Он назвал их Bacillus radicicola. Сейчас все клубеньковые бактерии относят к роду Rhi- zobium. Видовые эпитеты даются по названию того растения, на котором они преимущественно образуют клубеньки:              Rh. Icguminosarum

(горох, вика, кормовые бобы, чечевица), Rh. phaseoli (фасоль), Rh.

Рис. 55. Заражение корня клубеньковыми бактериями 1 — бактерии в почве, 2 — начало инфекции, 3 — инфекционная нить, 4 — бактероиды

в клетке корня

japonicum (соя), Rh. lupini (люпин), Rh. trifolii (клевер), Rh. meliloti (люцерна, донник), Rh. robinii (акация) и т. д. Культуры клубеньковых бактерий хранятся сейчас в коллекциях разных стран. Они являются предметом многочисленных научных исследований и практического использования.

Клубеньковые бактерии — обычные обитатели почв. Они представляют собой мелкие, не более 3 мкм в длину, подвижные грамотрица- тельные палочки, очень сходные по многим признакам с псевдомонадами. Заражение растения происходит при прорастании семени, когда корень разрастается в почве и клубеньковые бактерии приходят в соприкосновение с корневыми волосками. Последние выделяют особые вещества белковой природы, получившие название лектинов. Бактерии, в свою очередь, выделяют на поверхности клетки полисахариды.

alt="" />

Рис. 56. Схема работы бактероида

ками бактероидов и окружающими их мембранами растительного происхождения. Синтез леггемоглобина производится растительной клеткой, а синтез исходного вещества — протогема — в бактероидах. Таким образом, между клетками растения-хозяина и внедрившимися в них бактериями устанавливаются тесные и сложные взаимоотношения. Каждый бактероид, окруженный мембраной, представляет собой своеобразную «азотфиксирующую единицу» (рис. 56). Энергия, необходимая для восстановления азота, поставляется в процессе распада АТФ, генерируемой митохондриями клетки-хозяина на окружающей бактероид мембране. Леггемоглобин выполняет функции переносчика

кислорода к бактериальной клетке, которая нуждается в нем для дыхания. В то же время ферментная система связывания азота, синтезируемая бактериями, подавляется кислородом.

Разные расы клубеньковых бактерий одного и того же вида отличаются не только вирулентностью (способностью заражать растение), но и активностью, или эффективностью, которая определяется по способности фиксировать азот в симбиозе с растением. Механизм фиксации азота клубеньковыми бактериями тот же самый, что и у аэробных (Azotobacter) и анаэробных (Clostridium) несимбиотических бактерий. В основе его лежит процесс восстановления азота водородом с участием нитрогеназы. Первым продуктом азотфиксации является аммоний, который связывается углеродными скелетами с образованием аминосоединений, в первую очередь аминокислот.

Вскоре после открытия роли клубеньковых бактерий в накоплении азота бобовыми растениями делались попытки использовать эти бактерии для обработки семян бобовых перед посевом. Приготовленные на основе клубеньковых бактерий препараты получили в разных странах свои названия. Изготовленный впервые в Германии в 1896 г. препарат был назван нитрагином. В 1906 г. он был получен в Англии, в 1907 г. — в США. В Чехословакии препарат клубеньковых называют нитразоном, в Австралии — нитрофиксом. В СССР первые партии нитрагина были изготовлены в 30-х годах. Существуют разные типы нитрагина в зависимости от способа его приготовления: смесь бактерий с сухим наполнителем для опыления семян; водная суспензия бактерий для опрыскивания; препарат для инокулирования семян методом вакуумной инфильтрации. В нашей стране выпускают влажный препарат на основе торфа — ризоторфин.

Инокуляция бобовых клубеньковыми бактериями особенно эффективна в случаях, когда в почве отсутствуют соответствующие растению микроорганизмы. Даже высокие дозы азотных удобрений заметно не увеличивают урожаев бобовых растений. Это говорит об их способности полностью покрывать свою потребность в азоте путем его фиксации за счет клубеньковых бактерий. Лишь очень высокие дозы азотных удобрений (gt;300 кг/га азота) тормозят образование клубеньков.

До 30-х годов считали, что клубеньковые бактерии способны связывать молекулярный азот и в чистых культурах без растения. Эта теория была отвергнута, когда появились более точные методы определения азота. В последние годы она вновь возрождена благодаря тому, что после вскрытия механизма работы клубенька, для культивирования клубеньковых бактерий применили специальные приемы, воспроизводящие условия их пребывания в клетках растения-хозяина. Для этого необходимо создание определенного окислительно-восстановительного потенциала, наличие небольших («стартовых») доз связанного азота и источника углерода в виде органических кислот, например янтарной кислоты. Таким образом было доказано, что клубеньковые бактерии способны к азотфиксации в чистых культурах. Для неко

торых представителей клубеньковых бактерий, как и для свободножи- вущих азотфиксаторов родов Derxia, Azolobacter и Azospirillum, показана возможность роста в условиях автотрофии — за счет использования Н2 и СОг при наличии кислорода.

Известно более 250 видов разных растений, в том числе и голосеменных, у которых обнаружены микробные симбионты на корнях или листьях. Они описаны даже для наиболее древних на Земле высших растений из голосеменных — гинк- го. На листьях некоторых тропических растений образуются узелки, в которых поселяются бактерии рода Klebsiella, фиксирующие азот. На корнях деревьев (ольха), кустарников и полукустарничков (облепиха, вереск и др.), травянистых растений (лисохвост, щучка) давно

обнаруживали разрастания, похожие на клубеньки бобовых. Выделить из них микроорганизмы-симбионты трудно. Еще труднее доказать их участие в азотфик- сации. Из клубеньков ольхи многократно удавалось выделить микроорганизмы, по многим признакам близкие к актино- мицетам (рис. 57). Они были отнесены к новому роду Frartkia. Длительно поддерживать их на лабораторных средах пока не удается.

Микробные симбионты-диазотрофы есть и у животных. Доказана способность к азотфиксации у бактерий кишечной группы рода Escherichia, живущих в качестве комменсалов в пищеварительном тракте человека. Найдены азотфиксаторы, обитающие во внутренних органах морской свинки, домашней свиньи. Описаны азотфиксирующие симбионты у растительноядных сосущих насекомых и у термитов. Эта область исследований еще мало разработана и организмы-симбионты во многих случаях плохо идентифицированы. Здесь, по-видимому, предстоит еще много открытий.

Проблема использования биологического азота, который вовлекается в круговорот азотфиксирующими микроорганизмами, тесно связана с важнейшей проблемой нашей жизни — обеспечением растущих потребностей населения планеты продовольствием. Продуктивность сельскохозяйственных растений в первую очередь зависит от азотного баланса почв. В этом плане проблема круговорота азота в природе имеет прямое отношение к практической деятельности человека.

Один из путей ликвидации белкового дефицита — широкое использование бобовых культур, зерно которых содержит до 40—50% белка и до 20% жира. Белок бобовых включает незаменимые аминокислоты _ лизин, метионин, триптофан. По качественному составу он близок к белкам молока, мяса, яиц. Бобовые обогащают почву азотом. В зависимости от условий роста растений они накапливают от 60 до 300 кг азота на гектар в год. При этом 2/3 усвоенного азота бобовые растения берут из воздуха за счет его фиксации клубеньковыми бактериями и 1/3 — из минеральных соединений почвы. Однако из известных 13 000 видов бобовых всего только 200 видов используются в сельском хозяйстве. Посевные площади, занимаемые бобовыми, невелики по сравнению с общим фондом обрабатываемых земель. В СССР из общей пахотной площади в 226 млн. га под зернобобовыми находится лишь 6,2 млн. га, под кормовыми бобовыми — 19 млн. га. В общем бобовые культуры занимают 11% пахотных земель. В природных биогеоценозах бобовые также составляют низкую долю. В зрелых (климаксных) экосистемах они вообще отсутствуют. Поэтому, несмотря на их большую эффективность в отношении связывания азота и обогащения им почвы, в общем азотном балансе биосферы бобовые не играют решающей роли.

Так называемые свободноживущие азотфиксаторы распространены повсеместно. Однако их эффективность значительно ниже, чем у симбиотических микроорганизмов. Их активность повышается в том случае, если они развиваются в зоне корневой системы растения или непосредственно на корнях в ризоплане, т. е. в ассоциации с растением. Опыты показали, -что процесс ассоциативной азотфиксации сопряжен с фотосинтезом (рис. 58) и протекает как в ризосфере, так и в филло- сфере. Это доказывается наличием суточной ритмики обоих процессов. Результаты экспериментов со стерильными растениями, к которым добавляли смесь азотфиксирующих микроорганизмов, показали, что растения могут жить, целиком покрывая свои потребности в азоте за счет азотфиксации.

Почему же растение так сильно влияет на азотфиксацию? Уровень азотфиксации определяется количеством доступной энергии. Для восстановления 1 М N2 требуется 15—20 М АТФ. Источниками энергии в почве под растениями могут быть корневые выделения, слизи, продукты корневого отпада — прижизненно отчуждаемые органические вещества. Количество их определяется неоднозначно. Долгое время считали, что они составляют незначительную долю от общей продуктивности растений, всего 1—5%. За последние годы было показано, что количество органического вещества, поступающего в ризосферу, в 3—4 раза превосходит количество корневых остатков в конце вегетации. Корневая экссудация вместе с прижизненным корневым отпадом за период вегетации может составить 25—30 и даже 40—50% от общего количества фотосинтезированного углерода. Исходя из этого расчета следует оценивать вклад несимбиотрофных почвенных микроорганизмов примерно в 10—25 кг N2 на гектар в год для почв средней полосы и до 50—100 кг — в субтропической и тропической зонах.

Азот, накопленный биологическим путем, находится в форме органических соединений, преимущественно белка. Он накапливается постепенно, в течение всего вегетационного периода, и используется растениями только после отмирания микробных клеток и их распада, что происходит относительно медленно.

Рис. 58. Сопряжение процессов фотосинтеза и азотфиксации (по М. М. Умарову, 1982)