Определение витамина в биологических жидкостях и тканях.  

Принцип.

Реактивы: 1) культура Escherichia coli 113-3. Ее выращивают на агаровых косяках и хранят в холодильнике. Раз в месяц культуру пересевают на свежую агаровую среду и после пересева выдерживают 24 ч в термостате при 37 °С;

2. агаровая среда. Состав агаровой среды в расчете на 100 мл:

а)              казеиновый кислотный 10%-ный гидролизат — 6 мл; б) калия фосфат двузамещенный (К2НРО4) — 20 мг; в) железа сульфат (FeS04‘7H20) — 0,5 мг. 100 мг FeS04*7H20 разводят в 100мл дистиллированной воды, отсюда берут 0,5 мл; г) магния сульфат (MgS04 • 7Н2О) — 20 мг. Указанные компоненты растворяют последовательно в одной порции воды; д) L-аспарагин — 20 мл (L-ac- парагин растворяют отдельно с прибавлением нескольких капель 1 н. раствора НС1 при слабом подогревании и затем прибавляют к вышеуказанному раствору. pH раствора доводят 1 н. раствором NaOH до 7,0. Затем добавляют); е) глицерин (10 г глицерина добавляют к 50 мл дистиллированной воды, отсюда берут 1 мл);

ж)              агар-агар — 1,5 г; з) витамин В12 (из ампулы, содержащей 100 мкг/мл, берут 0,1 мл) — 10 мкг; и) вода дистиллированная — 100 мл.

После подогревания на водяной бане до растворения агара вносят витамин В12, смесь тщательно перемешивают, разливают в пробирки по 50 мл и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 105 Па (1 атм);

3. основная среда.
   Состав основной среды на 1 л: а) калий фосфорнокислый двузамещенный (К2НРО4) — 14 г; б) калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО4) — 6 г; в) натрий лимоннокислый (СбН507№з • 5Н20) — 1 г; г) магний сернокислый (М§804 х х 7Н20) — 0,2 г; д) аммоний сернокислый [(МЩ^С^] — 2 г; е) натрия хлорид (ЫаС1) — 1,0 г, ж) калия цианид (КСЫ) — 2 мг;

з)              вода дистиллированная — до 1 л.

Указанные ингредиенты растворяют последовательно в дистиллированной воде. Калия цианид добавляют в виде раствора, в 1 мл которого содержится 0,1—0,2 мг. Конечный pH среды должен быть в пределах 6,8—7,0. Во избежание потемнения при повторных стерилизациях растворы солей и глюкозы (4 г на 1 л дистиллированной воды) готовят и стерилизуют отдельно кипячением в течение 30 мин. Непосредственно перед опытом оба раствора, т. е. основную массу с калия цианидом и раствор глюкозы, смешивают в соотношении 1:1;

4. агар;
5. ацетатный буфер. Готовят растворением в ацетате натрия тригидрата 13,61 г и 6 г 100%-ной уксусной кислоты в 1 л дистиллированной воды;
6. 1 н. раствор №ОН;
7. 0,2 н. раствор ЫаОН;
8. 1 н. раствор НС1;
9. 0,2 н. раствор НС1;
10. толуол;
11. витамин В[2 в ампулах, применяемый для терапевтических целей;
12. дистиллированная вода.

Оборудование: термостат; сушильный шкаф; автоклав; аналитические весы; водяная баня; фарфоровые ступки и пестики; бюретки; мерные колбы на 100, 250 и 1000 мл; мерные цилиндры на 100 мл; воронки; стаканчики на 150—200 мл; пипетки; промывная колба; беззольные фильтры; пробирки 20 х 160 мм; центрифужные пробирки: марлево-ватные пробки; бактериальная петля.

Ход определения. Обработка содержимого рубца. Содержимое рубца разводят дистиллированной водой в соотношении 1:100. К 1 мл разведения, взятого в пробирку, добавляют 1 мл ацетатного буфера с pH 4,63 и доводят водным раствором калия цианида (концентрация 1,2 мг/л) до объема 20 мл.

Обработка ткани печени. Ткань печени, замороженную в жидком кислороде или азоте, растирают в фарфоровой ступке. Берут навеску 100 мг и тщательно растирают с 0,5 мл ацетатного буфера и небольшим количеством вышеупомянутого раствора калия цианида, переносят в колбочку и доводят раствором последнего до 50 мл. Затем колбочки закрывают марлево-ватными пробками и помещают на 15 мин в кипящую водяную баню, дают остыть, фильтруют, разводят дистиллированной водой 1:10 000 и при помощи

1. н. раствора NaOH или 0,2 н. раствора НС1 доводят pH до 6,8—7,0.

Обработка ткани мышц. Ткань мышц, замороженную в жидком кислороде или азоте, растирают в фарфоровой ступке. Берут 200 мг ее и тщательно растирают с 1 мл ацетатного буфера и небольшим количеством раствора калия цианида, переносят в колбочку и доводят этим раствором до 20 мл. Затем колбочку закрывают марлево-ватными пробками и помещают на 15 мин в кипящую водяную баню, дают остыть, фильтруют и при помощи 1 н. раствора NaOH или 0,2 н. раствора НС1 доводят pH до 6,8—7,0.

Приготовление стандартного раствора витамина В12. Для получения калибровочной кривой используют водный раствор витамина В[2, в 1 мл которого содержится 0,1 мкг витамина. Раствор хранят в холодильнике с притертой пробкой под слоем толуола. В день опыта делают дальнейшее разведение в 2000 раз до содержания 0,00005 мкг витамина В12 в 1 мл (50 пкг).

Постановка опыта включает приготовление стандартного ряда исследуемых и контрольных образцов.

Стандартный ряд.

Исследуемые образцы. Для каждого исследуемого образца берут 6 пробирок (таких же, как для стандартного ряда). Затем в пробирки вносят по 5 мл основной среды и добавляют различные количества исследуемого материала (экстракта) — 0,5; 1,0; 1,5 мл, а на каждую градацию берут две пробирки. Объем раствора во всех про

бирках доводят дистиллированной водой до 10 мл и стерилизуют, как стандартный ряд.

Контрольные образцы. 2 мл обработанного материала в пробирке смешивают с 2 мл 0,2 н. раствора NaOH и кипятят в водяной бане в течение 30 мин. После охлаждения доводят pH раствора до 6,8—7,0 при помощи 10—12 капель 0,2 н. раствора НС1 или 0,2 н. раствора NaOH и фильтруют через беззольный фильтр с последующим промыванием дистиллированной водой. Фильтрат переливают в пробирку, содержащую 5 мл опытной среды, дополняют дистиллированной водой до 10 мл и стерилизуют, как и опытныlt;е образцы. Для каждого исследуемого материала готовят два таких образца.

Посев. В стандартный ряд исследуемые и контрольные образцы вносят по одной капле из одной и той же пипетки бактериальной взвеси, приготовленной следующим образом. Две центрифужные пробирки с 5 мл опытной среды и 5 мл стандартного раствора витамина В12 (50 пкг/мл в каждой) стерилизуют в кипящей водяной бане в течение 30 мин и после охлаждения засевают E. coli с твердой агаровой средой. Засеянные пробирки ставят в термостат при 37 °С на 20—24 ч. Затем бактериальную суспензию центрифугируют 15—20 мин при 4000 мин .

Учет интенсивности роста E. coli. По окончании инкубации содержимое каждой пробирки взбалтывают и замеряют мутность на фотоэлектроколориметре (ФЭК-М) при синем светофильтре по шкале, показывающей процент пропускания света. По полученным данным строят калибровочную кривую. При построении стандартной кривой лучше не соединять все полученные точки, а провести плавную кривую между ними. По величине светопропус- кания трех параллельных пробирок (берут среднее арифметическое) на оси абсцисс находят соответствующее количество витамина в данной пробирке. Для этого откладывают на оси ординат среднее значение мутности для каждой точки стандартного раствора витамина В]2, содержащегося в данной пробирке. Затем, учитывая количество обработанного материала, высчитывают концентрацию витамина умножением на разведение. Из полученных величин берут среднюю, а из полученной средней вычитают полученную в контрольном опыте.

Точность и воспроизводимость метода при прочих равных условиях в значительной степени зависят от применяемой культуры E. coli, чувствительность которой к витамину Bi2 может значительно меняться в зависимости от условий культивирования — частоты пересева, качества твердой среды, температурного режима и других факторов.

Клиническое значение. Витамин В|2 синтезируется микроорганизмами рубца и кишечника. Для синтеза цианкобала- мина используют микроэлемент кобальт. В тканях кобаламин образует коферментные формы: метилкобаламин и дезоксиаденозин- кобаламин, которые участвуют в реакциях образования метионина, превращения метилмалонил-КоА в сукцинил-КоА, в образовании коферментных форм фолацина, а следовательно, в синтезе ДНК и в пролиферации кроветворных клеток.

Недостаток кобаламина отмечается при дефиците протеина, кобальта, болезнях желудочно-кишечного тракта, сопровождаемых нарушением микробиального синтеза витамина В|2- Гиповитаминоз В[2 характеризуется нормо- или гиперхромной мегалобластической анемией, плохим усвоением белка и как следствие этого исхуданием, снижением в крови, тканях, рубцовом содержимом концентрации кобаламина.

Содержание витамина В|2 в различных материалах (по данным Львовской государственной академии ветеринарной медицины)

Содержимое рубца жвачных животных              5—12 мкг%

Печень крупного рогатого скота              300—600 мкг/кг

Почки крупного рогатого скота              200—500 мкг/кг

Мышцы крупного рогатого скота              10—18 мкг/кг

Печень свиньи              60—84 мкг/кг

Кровь крупного рогатого скота              10—18 нг%

Кровь свиньи              5—14 нг%

При гиповитаминозе В^ кобаламина в крови телят и поросят содержится менее 78 нмоль/л, в печени — менее 0,1 мкг/г; выделение метилмалоновой кислоты с мочой возрастает до 30 мкг/л (В.