Лабораторная работа № 18. ТЕСТ-СИСТЕМА ЭЙМСАДЛЯАНАЛИЗА МУТАГЕННОЙ И КАНЦЕРОГЕННОЙ АКТИВНОСТИХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ {Лабораторная работа подготовлена В. М. Глазером и С. В. Котелевцевым)

Химические и радиоактивные элементы могут индуцировать мутации всех типов (см. гл. 3). Универсальный метод одновременного выявления всех типов мутаций отсутствует, поэтому на прак-
тике используют набор тестов для обнаружения способности исследуемого соединения вызывать разные типы мутаций. На первом этапе осуществляют скрининг большого количества соединений на мутагенную активность с помощью простой, быстрой, дешевой и в то же время высокочувствительной тест-системы Эймса — Salmonella/микросомы на генные мутации. Основная задача теста Эймса — выявление генетической активности у тестируемых агентов. Соединения, проявившие мутагенную активность, подвергают детальному изучению с применением более сложных тестов, способных выявлять и оценивать другие генетические аномалии, такие, как хромосомные перестройки в клетках млекопитающих in vivo и in vitro, доминантные летали у мыши, рецессивные летали у дрозофилы, повреждения ДНК и др.
У бактерий отсутствует система микросомного окисления, которая имеется у животных, но этот недостаток удается преодолеть путем введения в тест-систему препарата, содержащего микросомы и кофакторы микросомного окисления (микросомная активирующая смесь — MAC). Добавление этой смеси обеспечивает мик- росомальную активность (МА) ксенобиотиков in vitro. Пробы без МА позволяют выявить прямую мутагенную активность, пробы с МА — промутагенную. При использовании тест-системы Эймса обнаруживается высокая (порядка 90 %) корреляция между мутагенной и канцерогенной активностью ксенобиотиков.
Быстрое выполнение теста в значительной мере обусловлено тем, что он является полуколичественным: частота мутаций определяется относительно общего количества клеток в обработанной суспензии без учета их выживаемости, а не количества выживших после обработки клеток, как это делается в количественном тесте.
В основе тест-системы лежит специально созданный Б.Н. Эймсом и его сотрудниками набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. Здесь будут описаны только штаммы, имеющие непосредственное отношение к данной лабораторной работе. Все штаммы происходят от лабораторного штамма LT-2, у которого были выделены ауксотрофные по гистидину мутанты hisG46 (мутация замены оснований) и hisD3052 (мутация типа сдвига рамки считывания) и др. Мутагенную активность оценивают по частоте возникновения обратных мутаций (реверсий) к прототрофности по гистидину (his*). Мутация hisG46 ревертирует под действием мутагенов, вызывающих замены оснований, hisD3052 — под действием агентов, индуцирующих сдвиг рамки считывания.
Принцип метода Эймса заключается в регистрации способности испытуемого соединения и (или) его метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активности in vitro. Индикаторные бактерии вместе с исследуемым препаратом, гомогенатом печени крысы и кофакторами (НАДФ, глюкозо-6-фосфат) вносят в слой верхнего полужидкого агара на чашки Петри с твердой средой А (см. справочный материал к лабораторной работе № 18), обеспечивающей отбор клонов ревертантов His*. Под влиянием ферментов, содержащихся в гомогенате печени млекопитающего, в результате функционирования системы микросомного окисления препарат может претерпевать ряд метаболических превращений. Как исходное вещество, так и его метаболиты, если они обладают мутагенной активностью, индуцируют мутации у микроорганизмов. Через 2 суток инкубации при 37 °С проводят подсчет колоний ревертантов на чашках.
Все пробы ставят в трех повторностях. Для получения более достоверной информации о свойствах исследуемого вещества используют несколько его доз. В табл. 18.1 и 18.2 представлены схемы постановки эксперимента в качестве образцов. Использованы известные мутагЬны и промутагены. Цифры в таблицах обозначают номера проб в порядке их использования в эксперименте.
Оборудование, материалы и реактивы:
минимальная среда А (4-кратный солевой раствор); стерильный водный агар (12 г в 750 мл дистиллированной воды); стерильный 10%-й раствор MgS04- 7Н20; стерильный 40%-й раствор глюкозы; МПБ (см. справочный материал к лабораторной работе N° 5); стерильный полужидкий агар (0,6 г агара и 0,6 г NaCl в 1 л дистиллированной воды); раствор L-гистидина (0,96 мг/мл); раствор биотина (0,7 мг/мл); физиологический раствор (0,6—0,7%-й NaCl); микросомная фракция S9 (см. справочный материал к лабораторной работе № 18); 0,1 М КС1; 9,85%-й КС1; 6,5%-й MgCl2; НАДФ; глюкозо-6-фосфат; 0,2 М фосфатный буфер pH 7,4; ампициллин или карбенициллин; автоклав; центрифуга; стеклянные колбы на 1 л на 250 мл (4 шт.); пробирки; пипетки на 1, 2 и 10 мл; чашки Петри; культуры штаммов Salmonella typhimurium ТА100 и S. ty- phimurium TA98; стандартные мутагены и испытуемые химические соединения (табл. 18.1 и 18.2); термостатированная водяная баня на 44 —46 °С; термостат на 37 °С.
Перед постановкой теста Эймса необходимо провести предварительную работу, включающую следующие этапы.
• В колбу с расплавленным агаром (750 мл) внести 250 мл 4-кратного солевого раствора, 0,5—1 мл 10%-го раствора MgS04 и 8 мл 40%-й глюкозы, перемешать и после охлаждения до 50 — 60 °С разлить по 25 мл в стерильные чашки Петри, расставленные на горизонтальной поверхности. После затвердения агара на дне чашек проставить номера проб согласно табл. 18.1 и 18.2 (каждый в трех повторностях). Затем расположить чашки в стопки по 9 — 12 шт. таким образом, чтобы в ходе эксперимента было удобно брать их в порядке нумерации.
До начала работы колбу с полужидким агаром выдержать в кипящей водяной бане до полного расплавления агара. Затем добавить по 10 мл растворов L-гистидина и биотина. Смесь перемешать и разлить по 2,5 мл в пробирки. Пробирки закрыть ватномарлевыми пробками и стерилизовать в автоклаве. Биотин необходимо добавлять в среду, так как индикаторные штаммы ауксо- трофны по нему. Гистидин вносят с таким расчетом, чтобы дать возможность бактериальным клеткам пройти 1 — 2 цикла деления, что необходимо для фиксации мутаций. Перед опытом агар в пробирках расплавляют в кипящей водяной бане и помещают в термостатированную водяную баню при 44—46 °С. Перед постановкой эксперимента клетки индикаторных штаммов выращивают в мясопептонном бульоне (МПБ) в течение ночи при 37 °С при интенсивном перемешивании. Желательно добавить в среду ампициллин или карбенициллин в конечной концентрации 25 мкг/мл. Полученные культуры содержат клетки в концентрации (2—5)109 клеток/мл. Культуру штамма Salmonella typhimurium ТА100 развести непосредственно перед экспериментом в 20 раз физиологическим раствором. Клетки штамма Salmonella typhimurium ТА98 осадить центрифугированием и ресуспендировать в таком объеме физиологического раствора, чтобы повысить концентрацию клеток в 2—3 раза. Различия в концентрациях суспензий обусловлены отличиями частот спонтанных реверсий между штаммами. Приготовить растворы мутагенов и испытуемых химических соединений. Концентрация вещества должна быть в 10 раз выше его дозы, так как в пробу вносят 0,1 мл раствора.

Например, если доза 2-аминоантроцена в пробе должна составлять 0,5 мкг, готовят его раствор в диметилсульфоксиде (ДМСО) с концентрацией 5 мкг/мл. Растворы, приготовленные на ДМСО или других органических растворителях, не стерилизуют, водные растворы стерилизуют пропусканием через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,2—0,45 мк. Растворы лабильных соединений готовят непосредственно перед опытом. Микросомную активирующую смесь (MAC) готовят непосредственно перед опытом в ледяной бане и выдерживают в ней в течение всего эксперимента. Растворы НАДФ и глюкозо-6-фосфа- та приготовить путем растворения навески вещества в стерильной воде в стерильной пробирке без дополнительной стерилизации. Для приготовления проб без МА из смеси MAC исключают фракцию S9 (заменить на равный объем 0,1 М КС1), растворы НАДФ и глюкозо-6-фосфата (заменить на равные объемы дистиллированной воды). Все операции, кроме посева бактерий в МПБ, можно проводить в помещении, предварительно обработанном ультрафиолетовыми лучами, без использования горелок.
• Удобно ставить опыт в порядке нумерации проб одновременно в 6—12 пробирках.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
Обработку клеток индикаторных бактерий проводят в полужидком агаре. Необходимо поставить две контрольные пробы. Первая должна содержать растворитель вместо химического соединения (показывает спонтанный уровень реверсий). Вторая проба ставится на активность MAC (в этом качестве удобен промутаген 2-аминоантрацен (0,5 мкг на пробу), который не повышает частоту реверсий в пробах без МА, но в результате МА продуцирует широкий спектр мутагенов, резко повышающих частоту реверсий у обоих индикаторных штаммов. Если МА активна, продукты метаболизма 2-аминоантрацена повышают частоту реверсий у штамма ТА100 в 5 —10 раз, у штамма ТА98 — в сотни и более раз. Снять пробки с пробирок с расплавленным на водяной бане полужидким агаром и, не вынимая пробирки из водяной бани, в каждую добавить 0,1 мл растворителя (Н20 или ДМСО) для контрольных проб или 0,1 мл раствора исследуемого соединения; 0,1 мл суспензии индикаторных бактерий; 0,5 мл MAC (для проб с МА) или 0,5 мл смеси без фракции S9, НАДФ и глюкозо-6- фосфата (для проб без МА).
Внимание! Ввиду лабильности MAC в момент ее добавления пробирку вынуть из водяной бани (для проб без МАэта предосторожность не нужна). Содержимое пробирок быстро перемешать 3—А резкими круговыми движениями пробирки между зажатыми ладонями и вылить на поверхность минимальной среды в чашке Петри. Осторожными, но быстрыми покачиваниями чашки верхний слой полужидкого агара равномерно распределить по поверхности и чашку поставить на горизонтальную поверхность. Верхний слой не должен застыть до его распределения по поверхности агара. Через 20 мин чашки перевернуть вверх дном и поместить в термостат на 37 °С на 40—48 ч.
Таблица 18.3
Оценка мутагенной активности химических веществ по тесту Эймса

Кратность превышения среднего числа колоний ревертантов в данной опытной пробе над контролем	lt;1,7	1,7-10	10-100	gt;100
Мутагенная активность	Не выявлена	Слабая	Средняя	Сильная

После инкубации подсчитать колонии ревертантов His+. Результаты внести в рабочие таблицы (табл. 18.1 и 18.2). Вычислить средние количества колоний ревертантов для каждой пробы по трем повторностям. Оценку результатов произвести, исходя из критериев, предложенных в табл. 18.3.
8. Если индукция мутаций проявляется в пробах без МА, сделать заключение о прямой мутагенной активности исследуемых химических препаратов, если только в пробах с МА — о промута- генной активности.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Приготовление минимальной среды А
Готовят 4-кратный солевой раствор: натрий лимонно-кислый трехзамещенный • 5,5Н20 — 2,24 г; К2НР04- ЗН20 — 55 г; К2НР04 — 18 г; (NH4)2S04 — 4 г; дистиллированная Н20 — 1 л; pH раствора доводят КОН до 7,2—7,3. Раствор разливают порциями по 250 мл и стерилизуют в автоклаве.
Приготовление микросомной активирующей смеси (MAC)
Для получения 50 мл MAC требуются (все растворы стерильные): 0,2 М фосфатный буфер pH 7,4 — 25 мл (см. прилож. 16.1); раствор НАДФ (32 мг/мл) — 5 мл; глюкозо-6-фосфат (15 мг/мл) — 5 мл; 9,85%-й КС1 — 1,25 мл; 6,5% MgCl2 — 1,25 мл; фракция S9 — 15 мл.
Приготовление фракции S9
Индукцию синтеза микросомных ферментов печени самцов белых беспородных крыс производят внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл раствора Aroclor 1254 (или Совола) в оливковом масле из расчета 100 мг на 1 кг веса животного. Через 48 ч крыс, получавших все это время только воду, забивают после предварительного наркоза декапитированием согласно принятым правилам работы с лабораторными животными. Все остальные операции проводят в стерильных условиях.
Печень извлекают, взвешивают, промывают раствором 0,1 М КС1, измельчают ножницами и растирают в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком. Перед гомогенизацией печень заливают 5 объемами 0,1 М КС1, содержащего 1 мкМ ионола (для предотвращения перекисного окисления липидов) и 1 мг БСА (бычий сывороточный альбумин, фракция IV для связывания свободных жирных кислот). Все операции проводят на холоде. Растворы и инструменты должны быть стерильными.
Гомогенат центрифугируют при 9000 g в течение 30 мин при +2°С, и надосадочную жидкость (фракция S9) разливают на холоде (в емкости со льдом) порциями по стерильным пробиркам, после чего сразу используют в опыте или быстро замораживают. Полученная таким образом фракция S9 содержит широкий набор цитозольных и микросомных ферментов, в том числе ферменты НАДФ ¦ Н-генерирующей системы, обеспечивающие протекание реакций микросомного окисления. В 1 мл приготовленной таким образом фракции с концентрацией белка около 40 мг/мл содержатся микросомы из 250 мг печени. Образцы фракции следует проверять на бактериальное загрязнение. В случае загрязнения следует выделить новую фракцию. Фракцию можно хранить в замороженном состоянии при -20 °С и ниже в течение нескольких месяцев. Не допускается повторное замораживание неиспользованной фракции после оттаивания.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Фонштейн Л. М. Тест-система оценки мутагенной активности загрязнителей среды на Salmonella: Методическое указание / Л. М. Фонштейн [и др]. — М.: Наука, 1977.
Фонштейн Л. М. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем: Методические указания / Л. М. Фонштейн (и др.]. — М., ВИНИТИ, 1985.
McCann J. Detection of carcinogens and mutagens in the Salmonella / microsome test: Assay 300 chemicals / J. McCann [et al.] // Prac. Nat. Acad. Sci. — USA, 1975. — V. 72.

<< | >>

↑

Источник: О. П. Мелехова, Е. И. Егорова, Т. И. Евсеева. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование : учеб, пособие для сгуд. высш. учеб, заведений. 2007

Еще по теме Лабораторная работа № 18. ТЕСТ-СИСТЕМА ЭЙМСАДЛЯАНАЛИЗА МУТАГЕННОЙ И КАНЦЕРОГЕННОЙ АКТИВНОСТИХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ {Лабораторная работа подготовлена В. М. Глазером и С. В. Котелевцевым):

- Геоэкология - Основы экологии - Экологический мониторинг - Экология животных - Экология насекомых - Экология почв и агроэкология - Экология птиц - Экология рыб -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -