Лабораторная работа № 19. АБЕРРАЦИИ ХРОМОСОМВ КЛЕТКАХ КОРНЕВОЙ МЕРИСТЕМЫ РАСТЕНИЙПОД ДЕЙСТВИЕМ МУТАГЕНОВ[‡‡‡] {Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Детально хромосомы обычно изучают на стадии метафазы в митозе, когда происходит их максимальная спирализация, а сами хромосомы имеют вид плотных образований. Каждая хромосома состоит из двух хроматид.
Хромосомы каждого кариотипа обладают постоянством числа, формы и внутренней структуры, но несмотря на это, они способны изменяться спонтанно или под влиянием различных агентов: ионизирующих излучений (рентгеновского, нейтронного, альфа-, бета-, гамма-излучений) и химических веществ.
Изменения в хромосомах, передающиеся потомству, Г. де Фриз в 1900 г. назвал мутациями. По характеру преобразования генотипа различают генные, или точковые, мутации. Они представляют собой изменения отдельных участков хромосом на молекулярном уровне, которые не видны в световой микроскоп. Другую группу составляют перестройки хромосом (структурные мутации), которые можно изучать под микроскопом. Их возникновение связано с фрагментацией и перекомбинацией хромосом. В третью группу входят геномные мутации. Они связаны с изменением числа геномов (полиплоидия) или хромосом (анеуплоидия).
Под термином перестройки, или аберрации, хромосом обычно понимают изменения их структуры, вызванные перекомбинацией различных участков одной или разных хромосом под влиянием мутагенов. В отличие от точковых мутаций перестройки хромосом относят к структурным мутациям. Перестройки могут быть спонтанными и индуцированными. Поскольку такие мутации затрагивают значительные участки хромосом, они изменяют их морфологию, что удается обнаружить под микроскопом. При анализе перестроек исходят из того, что хромосома на протяжении клеточного цикла может быть дихроматидной (период G2, профаза, метафаза) и монохроматидной (Gb анафаза, телофаза). В зависимости от состояния хромосомы возникают различные типы перестроек: хроматидные, когда хромосома удвоена, или хромосомные, когда она не удвоена.
Делеции, или потери участка хромосомы, могут быть хромосомные и хроматидные. Инверсия возникает в результате повреждений в хромосоме или хроматиде, когда внутренний участок переворачивается на 180°. Транслокации относятся к межхромосомным обменам. При этом происходит перемещение участка одной хромосомы в другую. В справочном материале к лабораторной работе № 19 приведены некоторые перестройки хромосом, наблюдаемые в метафазе митоза.
Для цитологических исследований очень важно понять, какие органы и ткани растения (или любого удобного для подобного рода анализа организма) необходимы для работы. Например, митоз можно наблюдать в меристемах молодых быстрорастущих корней растений, в главных корнях проросших семян, в конусах нарастания стебля. Обычно для изучения митоза и подсчета числа хромосом в соматических тканях растения предпочитают работать с молодыми корнями, так как в них непосредственно под чехли- ком находится зона активного деления клеток (конус нарастания корня) и фигуры деления здесь удобно ориентированы.
У злаков корни трудно раздавливаются, а цитоплазма клеток нередко сильно окрашивается красителями, поэтому изучение митозов и хромосом у них можно проводить на стеблевой меристеме.
При метафазном методе изучения хромосомных нарушений под действием, например, ионизирующих излучений, корни перед фиксацией необходимо обработать водным раствором колхицина. Облучать можно как сухие, так и проросшие семена. Ниже приводится последовательность обработки проросших семян. Замочить семена в воде в течение 1 —1,5 сут при температуре 25 °С. Проростки с корнями длиной 1,5—2,5 мм облучить в дозе 2 • 10-4 Кл/кг на влажной бумаге и оставить расти в чашках Петри. За 2 ч до фиксации проростки поместить в 0,01%-й раствор колхицина.
В микроскопической технике широко применяют временные давленные препараты. Наиболее часто для их изготовления используют фиксаторы Карнуа (6:3:1), Ньюкомера (6:3:1:1 :1), Наталья (5: 5:1:1), уксусный алкоголь (3:1).
Фиксированные препараты хранят в холодильнике в фиксаторе или промывают в 96%-м растворе этилового спирта и хранят в 70%-м растворе до окрашивания.
При изготовлении давленных препаратов исключительное значение имеют способы мацерации (от лат. maceratio — размягчение; в данном случае обработка объекта, чтобы вызвать распад ткани на отдельные клетки) тканей до окрашивания. Обычно для этого используют 45%-й раствор уксусной кислоты (для твердых объектов его подогревают). Окрашивают препараты ацетокармином, ацетоорсеином и др.
Для получения интегральной характеристики цитогенетического состояния живых организмов (помимо человека) В. М. Захаровым предложена балльная шкала: балл — условно нормальное состояние, частота аберрантных клеток до 5 % (в лимфоцитах человека 1 — 2 %); балла — низкая степень изменения, частота аберрантных клеток в пределах 6 —10 %; балла — средняя степень изменения, частота аберрантных клеток в пределах 11 — 15%; балла — высокая степень изменения, частота аберрантных клеток в пределах 16—20 %; баллов — критическое состояние, частота аберрантных клеток выше 20 %.
Условно нормальный уровень находится в пределах колебаний спонтанной частоты аберрантных клеток. Этот показатель изменяется в зависимости от вида, возраста, физиологического состояния, генетических особенностей организма. Однако многолетними исследованиями показано, что он не превышает 5 % (по некоторым источникам — для человека не выше 2 %).
Принцип метода, предложенного в лабораторной работе, основан на учете хромосомных аберраций, возникших в клетках корневой меристемы растений после обработки семян мутагенами.
Цель работы — балльная оценка качества проросших семян, подвергнутых у-облучению в разных дозах.
Оборудование, материалы и реактивы:
микроскоп; спиртовка; пинцет; держатель для предметного стекла; предметные и покровные стекла; чашка Петри или кювета для прокрашивания; фильтровальная бумага; препаровальные наборы; красители — ацетотоорсеин или ацетокармин, дистиллированная вода; этанол; 45 %-й раствор уксусной кислоты; корешки (2 — 3 мм) пророщенных в течение 3 сут после у-облучения и фиксированных в уксусном алкоголе семян ячменя (14 хромосом), ржи (14 хромосом), гороха (14 хромосом) и лука (16 хромосом).
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ Получить у преподавателя фиксированные корешки растений, подвергнутые у-облучению в разных дозах. Приготовить «давленные» препараты из апикальной меристемы и окрасить ацетоорсеином (ацетокармином). Для этого корешки поместить на предметное стекло в каплю красителя и подогреть над пламенем спиртовки, доводя до легкого кипения несколько раз, особенно в том случае, если не была проведена мацерация в НС1.
Внимание! Корешки злаков труднее окрашиваются и мацериру- ются, поэтому приходится увеличивать время их окрашивания. Например, корни ячменя, пшеницы, ржи иногда выдерживают в ацетоорсеине от одних до полутора суток при комнатной температуре. На предметное стекло, где расположен объект, нанести каплю 45%-го раствора уксусной кислоты, отделить конус нарастания, удалить лишние ткани, накрыть покровным стеклом и фильтровальной бумагой и постукивать сверху, например тупой стороной карандаша, чтобы уложить клетки конуса нарастания в виде монослоя. В каждом препарате анализировать все метафазы, учитывая долю клеток с аберрациями хромосом. Анализ спектра аберраций провести по известной классификации с выделением хроматид- ных (одиночных) и хромосомных (двойных) фрагментов. В отчете представить рисунки аберраций. Сделать вывод о влиянии у-облучения на цитогенетические характеристики клеток корневой меристемы растений.
Рис. 19.2. Кариотипы:
А — ячменя; Б — ржи; В — гороха; Г — лука
7. Рассчитать частоту хромосомных аберраций (Ч, %), учитывая общее число клеток и клетки с хромосомными аберрациями, по формуле
где А — число клеток с нарушениями; В — общее число просмотренных клеток.
Внимание! Если в одной клетке обнаружено несколько типов нарушений, число клеток с нарушениями будет меньше общего
числа аберраций. Число аберраций на клетку (или 100 клеток) устанавливают, разделив общее число аберраций (С) на число просмотренных клеток (В). Рассчитать спектр аберраций (К) по формуле
где Д — число аберраций определенного типа; В — число просмотренных клеток. Определить долю аберраций каждого типа от общего числа всех аберраций, разделив число аберраций одного типа (Д) на общее число аберраций (С). Поврежденность клетки определить как отношение общего числа аберраций (С) к числу аберрантных клеток (А) и выразить в процентах. Оценить в баллах влияние мутагена на проростки злаков (см. в тексте).
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Фиксаторы
Фиксация материала, т. е. быстрое умерщвление клеток в специально подобранных растворах ядовитых реактивов, которые называются фиксаторами, прерывает тот или иной процесс в клетке, вызывая необратимые изменения. При этом коллоиды протопласта переходят в нерастворимое состояние.
Известно много фиксаторов, но каждый из них имеет определенное назначение. Очень важно выбрать такой фиксатор, который, убивая клетку, несильно искажает ее прижизненную структуру и отвечает целям исследования.
Обычно фиксатор представляет собой смесь нескольких реактивов, каждый из которых редко используется для фиксации вследствие одностороннего действия. В состав этих смесей могут входить: ледяная уксусная кислота, хромовая кислота, формалин, хлороформ, осмиевая кислота, спирт и др.
Уксусная кислота (СН3СООН) — бесцветная жидкость с резким запахом. Хорошо смешивается с водой, спиртом, эфиром, хлороформом. Кислота хорошо сохраняет форму хромосом, но разрушает митохондрии и комплекс Гольджи. В последние годы ее нередко заменяют при фиксации пропионовой кислотой, которая способствует лучшей фиксации и окрашиванию объектов.
Хромовая кислота проникает в объекты не очень быстро, коагулирует белки, сохраняет детали строения ядра, цитоплазмы, а также митохондрии и комплекс Гольджи. После фиксации хромовой кислотой объект необходимо тщательно промыть водой, иначе образуется осадок, мешающий окрашиванию тканей.
Осмиевая кислота представляет собой раствор сильного окислителя — тетраоксида осмия. Эта кислота медленно проникает в объект и вызывает наименьшие изменения в структуре цитоплазмы и ядра. Позволяет фиксировать митохондрии.
В цитологических и эмбриологических исследованиях широко применяют, особенно для изготовления давленных препаратов, «уксусный алкоголь», или фиксатор Кларка (3:1). Материал выдерживают в фиксаторе от 2 до 12 ч, а иногда и хранят в нем при 0-3 °С.
Состав уксусного алкоголя: абсолютный этиловый спирт или его 96 %-й раствор — 3 части, ледяная уксусная кислота —1 часть.
Красители
Ацетокармин. Растворить 1 г (лучше 2—4 г) кармина — красящего вещества, состоящего из кармиловой кислоты, — в 45 мл ледяной уксусной кислоты и 55 мл дистиллированной воды. Растворение проводить в колбе с обратным холодильником на водяной бане с подогревом около 3 ч. При отсутствии обратного холодильника в колбу вставить воронку. После остывания темно-красный раствор кармина отфильтровать и поместить в посуду с притертой крышкой. Остатки кармина на фильтре можно использовать повторно.
Ацетоорсеин. Готовят из орсеина — красителя, полученного из лишайника. Растворить 1 г орсеина в 45 мл горячей уксусной кислоты и добавить 55 мл дистиллированной воды. Кипятить на водяной бане 3 ч, остудить и отфильтровать.
Дубинин Л. Г. Структурные мутации в опытах с Crepis capillaries. — М.: Наука, 1978.
Паушева 3. П. Практикум по цитологии растений. — М.: Агропромиз- дат, 1988.
Последствия Чернобыльской катастрофы: Здоровье среды / под ред. В. М. Захарова, Е. Ю. Крысанова. — М.: Моек. отд. междунар. фонда «Биотест», 1996.
Экологический мониторинг. Методы биомониторинга: в 2 ч. / под ред. Д.Б.Гелашвили. — Н. Новгород: ННГУ, 1995.
Еще по теме Лабораторная работа № 19. АБЕРРАЦИИ ХРОМОСОМВ КЛЕТКАХ КОРНЕВОЙ МЕРИСТЕМЫ РАСТЕНИЙПОД ДЕЙСТВИЕМ МУТАГЕНОВ[‡‡‡] {Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой):
- 3 ГИГИЕНА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
- СВЕДЕНИЯ О ГЕЛЬМИНТОЗАХ ЛАБОРАТОРНЫХ ГРЫЗУНОВ
- Лабораторно-полевые ульи для шмелей
- АДЕНОВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ ОБЕЗЬЯН И ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
- Организация оплодотворения самок в лабораторных условиях
- ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АППАРАТУРЫ В ЛАБОРАТОРНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ
- ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ ТЕСТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВНУТРЕННИХ БОЛЕЗНЕЙ
- ГЛАВА 3 ЛАБОРАТОРНЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ
- ГЛАВА 19 ГИГИЕНА СОДЕРЖАНИЯ СОБАК, КОШЕК И ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
- 6.2. Исследование способности животных к символизации (на примере «счета») с помощью лабораторных тестов