Лабораторная работа № 17. БИОТЕСТИРОВАНИЕВОДОЕМОВ ПО УРОВНЮ БЕЛКОВ-МЕТАЛЛОТИОНЕИНОВВ МЯГКИХ ТКАНЯХ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ {Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой на основе методических разработок Б. И. Сынзыныса)

  Металлотионеины (МТ) — низкомолекулярные белки с молекулярной массой 6—7 до 15 кДа, способные связывать ионы тяжелых металлов Zn, Cd, Pb, Hg, Си и другие и содержащие до 30 % цистеина. Каждый белок способен одновременно связывать шесть двухвалентных и одиннадцать одновалентных металлов. МТ обнаружены во всех исследованных эукариотических и прокариотических организмах в концентрациях до 2—3 мкг/г клеток или ткани.
Показано участие этих белков в снижении токсичности ионов металлов и регуляции гомеостаза Zn и Cd в клетках. Синтез МТ в клетках и тканях индуцируется воздействиями токсической и генотоксической природы. В опытах in vitro и in vivo продемонстрирована роль МТ в снижении токсичности и детоксикации тяжелых металлов: связанные с МТ они менее токсичны.
Принцип предложенного в лабораторной работе метода основан на замещении ионов металлов, хелатированных в МТ, на радиоактивный I09Cd в мягких тканях двустворчатых моллюсков.

Объектами биотестирования воды по МТ используют моллюсков — перловицу (Unio pictorum) и беззубку (Anodonta sp.) (рис. 17.1) из семейства Unionidae размером 3—12 см. Внутреннее строение у них одинаково. Знание анатомии и умение препарировать позволяют определить содержание МТ в любом органе моллюска.
Можно провести моделирование загрязнения водоема кадмием в лабораторных условиях. Для этого беззубок культивируют в аквариумах с водопроводной водой, содержащей CdCl2 в концентрации 0,2 мг/л в течение 8 сут, 16 сут и 1 мес. Перенос моллюсков из реки в водопроводную воду является стрессирующим фактором, который может оказывать влияние на синтез МТ и на их жизнеспособность. Однако достоверных отличий в содержании МТ не обнаруживается, поэтому специальной адаптации при переносе не требуется. Препарирование можно осуществлять согласно анатомическому атласу внутреннего строения моллюсков (Е. Н. Ци- хон-ЛуканиНа). Извлеченные органы (жабры, печень, почки и мантия) очищают от посторонних включений и взвешивают. Исследования показали, что удельное содержание МТ в почках беззубок в 5 —7 раз выше, чем в печени, мантии и жабрах, и практически не зависит от возраста моллюсков. До начала анализа органы хранят при -40 °С.
Определение содержания МТ методом радиоактивных индикаторов проводят по методике D.L. Eaton и M.G. Cherian с модифи-

Рис. 17.1. Внутреннее строение беззубки Anodonta sp. (вид слева):
1 — пищевод; 2 — передний аддуктор; 3 — ротовое отверстие; 4 — нога; 5 — кишка; 6 — правая мантийная складка; 7 — предсердие; 8 — правая жабра; 9 — правая почка; 10 — задний аддуктор; 11 — вводящий сифон; 12 — анальное отверстие; 13 — выводящий сифон; 14 — клоакальная камера; 15 — прямая кишка; 16— спинной мантийный канал; 17— задний ретрактор ноги; 18— спинное мантийное отверстие; 19 — задняя аорта; 20 — артиовентрикулярный клапан; 21 — желудочек; 22 — полость перикардия; 23 — передняя аорта; 24 — печеночный проток; 25 — пилорическое отверстие желудка; 26 — желудок; 27 — отверстие печеночного протока; 28 — печень



кацией Б. И. Сынзыныса. Количество (АО МТ (мкг/г) определяют по формуле
(1)
где V — кратность разбавления образца; 17,8 — коэффициент; т — масса навески органа или ткани, г; А, К, С— количество распадов в пробе, контроле и стандарте соответственно.

Если содержание МТ в тканях равно 2— 3 мкг/г ткани моллюска, это свидетельствует о чистой воде на данном участке водоема. Более высокое удельное содержание говорит о постоянном наличии в воде тяжелых металлов.
Внимание! Концентрация и активность меченого вещества столь мала (0,1 % индикаторного реагента в воде при активности рабочего раствора 40 кБк/мл), что не требует создания особых условий безопасности для работы. Нельзя допускать попадания раствора в рот или на поверхность слизистых глаза; также следует тщательно собирать остатки раствора и отходы от опыта (неиспользованные части тел моллюсков) в контейнер и сдавать их на утилизацию.
Цель работы — определение удельного содержания МТ в мягких тканях двухстворчатых моллюсков, культивируемых в воде с солями тяжелых металлов.
Оборудование, материалы и реактивы:
аквариумы с отстоянной водопроводной водой, не содержащей и содержащей CdCl2 в концентрации 0,2 мг/л; беззубки или перловицы размером примерно 5 —10 см; индикаторный реагент: 109CdCl2 в 0,01М трис-HCl буфере, pH 7,4—8,2 (суммарная концентрация Cd2+ в смеси — 2,0 мкг/мл, радиоактивность — 40,0 кБк/мл); 2 %-й гемоглобин кролика; водяная баня; холодильник; центрифуга; гамма-счетчик.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ Получить у преподавателя моллюсков, культивируемых в контрольной воде и загрязненной солями Cd в течение разного времени. Извлечь жабры, печень, почки, мантию. Гомогенизировать органы в стеклянном гомогенизаторе Поттера в 0,01 М трис-HCl буфере. Гомогенат прогреть на кипящей водяной бане в течение 3 мин и быстро охладить во льду до 4 °С. Затем сразу центрифугировать при 10000g в течение 20 мин.
1-1
К 0,1 мл 0,01 М трис-HCl буфера, добавить 0,1 мл индикаторного реагента 109CdCl2. Затем добавить 0,2 мл пробы, перемешать и инкубировать 10 мин при комнатной температуре. Внести 0,1 мл 2 %-го гемоглобина кролика, перемешать, прогреть на кипящей бане 3 мин, охладить во льду. Эту операцию провести еще дважды. Далее центрифугировать 8 мин при 7 000 об/миН на высокоскоростной центрифуге. 0,2 мл супернатанта после центрифугирования перенести в пробирки для счета и измерить радиоактивность на гамма-счетчике («Beckman PU5500», США). Для каждой серии измерений провести анализ «контрольной» пробы (вместо исследуемой на МТ пробы вносят буфер) и общей активности (вместо исследуемой пробы и гемоглобина вносят буфер). Рассчитать количество МТ в каждой пробе по формуле (1). Сделать вывод о влиянии солей Cd в концентрации 0,2 мг/л на количество МТ в мягких тканях моллюсков по сравнению с контрольным уровнем.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Данилин И. А. Экспериментальное обоснование нового метода биотестирования пресноводных водоемов по содержанию белков металлоти- онеинов в органах и тканях двустворчатых моллюсков / И. А. Данилин [и др.] // Экология, 2002. — № 5.
Цихон-Луканина Е.Н. Трофология водных моллюсков. — М.: Наука, 1987.
Филенко О. Ф. Водная токсикология. — М.: Изд-во МГУ, 1988.
Roesijadi G. Metallotionein indication as a measure of response to metal exposure in aquatic animals // Enviton. Health. Perspect., 1994. — V.73.
Eaton D.L., Cherian M.G. Determination of metallotionein in tissues by cadmium-hemoglobin affinity assay // Methods.Enzymol., 1991- — V.205.

Еще по теме Лабораторная работа № 17. БИОТЕСТИРОВАНИЕВОДОЕМОВ ПО УРОВНЮ БЕЛКОВ-МЕТАЛЛОТИОНЕИНОВВ МЯГКИХ ТКАНЯХ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ {Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой на основе методических разработок Б. И. Сынзыныса):

1. Основы безопасности при работе со шмелями
2. Двустворчатые моллюски Арала
3. 3 ГИГИЕНА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
4. СВЕДЕНИЯ О ГЕЛЬМИНТОЗАХ ЛАБОРАТОРНЫХ ГРЫЗУНОВ
5. Организация оплодотворения самок в лабораторных условиях
6. Лабораторно-полевые ульи для шмелей
7.   ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ ТЕСТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВНУТРЕННИХ БОЛЕЗНЕЙ 
8.   ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АППАРАТУРЫ В ЛАБОРАТОРНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ  
9. АДЕНОВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ ОБЕЗЬЯН И ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
10.   ГЛАВА 3 ЛАБОРАТОРНЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ
11. ГЛАВА 19 ГИГИЕНА СОДЕРЖАНИЯ СОБАК, КОШЕК И ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
12. 6.2. Исследование способности животных к символизации (на примере «счета») с помощью лабораторных тестов
13.   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с., 2004
14. 5.2. Методические основы экспериментов по изучению операций обобщения и абстрагирования
15. Педагогическая работа
16. 2.2.4. Изучение условий поддержания и хранения культур М. pachydermatis в лабораторных условиях
17. НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ, ПРОЦЕССУАЛЬНЫЕ И ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ ОСНОВЫ СУДЕБНОЙ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ