Лабораторная работа №15. ИССЛЕДОВАНИЕ НАРУШЕНИЙРАЗВИТИЯ ЭМБРИОНОВ ВОДНЫХ ЖИВОТНЫХ С ПРИМЕНЕНИЕММЕТАБОЛИЧЕСКОГО КРИТЕРИЯ (Методика разработана О. П. Мелеховой и Г. В. Коссовой)

В данной работе предлагается освоить оригинальный метод оценки эмбриотоксичности воды, основанный на определении физиологического состояния зародышей по метаболическому критерию — уровеню свободнорадикальных реакций. Применение эмбриональных моделей в экспериментах по выявлению действия повреждающих факторов позволяет сделать предположения о механизмах повреждения, используя в качестве биотестов эмбрионы низших позвоночных на разных стадиях развития. В серии многолетних исследований автором метода был открыт универсальный метаболический параметр, характеризующий эмбриональные клетки в период детерминации, т.е. вступления в многоступенчатый процесс цитодифференцировки. Таким параметром оказалось активное развитие свободнорадикальных процессов. Удалось показать их участие в первичных стрессовых реакциях эмбриональных клеток при действии химических и радиационных повреждающих факторов. Предложенный в лабораторной работе радиоин- дикаторный метод выявления свободных радикалов лежит в основе нового метода биотестирования. Существенными преимуществами этого метода являются высокая чувствительность, возможность получения результатов в кратчайшие сроки (экспресс-метод), удобство для применения в полевых условиях. Важно отметить также, что результаты измерений метаболической стрессовой реакции при длительных наблюдениях коррелируют с последующими патологическими изменениями тест-объекта (см. лабораторную работу № 24).

Измерения уровня свободнорадикальных реакций осуществляются методом привитой сополимеризации с помощью радиоактивного индикатора.
Принцип метода подробно описан в лабораторной работе № 14.
Цель работы — экспресс-оценка эмбриотоксичности испытуемой водной среды по уровню свободных радикалов у эмбрионов и зародышей лягушек.
Оборудование, материалы и реактивы:
чашки Петри, микродозатор, мерные цилиндры (на 10 мл и более), пипетки, контейнер (с притертой пробкой) для раствора индикатора и для отходов, кювета, ножницы, пинцеты, весы аналитические, флаконы для сцинтилляционного счета, термостат, сцинтилляционный счетчик для измерения радиоактивности; 70%-й спирт; 0,1 %-й раствор индикатора (с активностью 37 кБк/мл), концентрированная НСЮ4, трис, сцинтилляционный раствор Брея.
Объекты исследования: зародыши (стадия гаструлы или нейру- лы) травяной (Rana temporaria L.) или шпорцевой (Xenopus laevis D.) лягушек, стандартизированные по возрасту. Стадии развития объектов определяли по таблицам Н. В. Дабагян и Л. А. Слепцовой для Rana temporaria L. (приведены в книге «Объекты биологии развития» — см. Список литературы) и П.Ньюкупа и Дж.Фабера для Xenopus laevis D. (приведены там же).
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
Для испытания чувствительности зародышей можно использовать следующие химические соединения: янтарную кислоту (биостимулятор); соли меди и лития; пестициды ДЦТ и атразин; соляровое масло. Все эти вещества встречаются в сточных водах техногенных зон. Уровень их токсичности, как и механизмы действия, различны. Проинкубировать по 25 зародышей, помещенных в чашки Петри с отстоянной водой, в присутствии токсикантов различной природы в концентрациях, близких к предельно допустимым хозяйственным, и без токсиканта. Длительность нахождения зародыша в токсиканте может составить от 1 до 30 ч. В табл. 15.1 занести данные о возрасте эмбриона (стадии развития), размере, характере аномалий, выживаемости. В среду для инкубации добавить радиоактивный индикатор (активность рабочего раствора — 3,7кБк/мл).

Инкубировать 90 мин в комнатных условиях. После трехкратного отмывания чистой отстоянной водой, не содержащей источников радиоактивности, перенести зародыши во флаконы для сцинтилляционного счета.

Эмбриотоксичность различных химических соединений по метаболическому критерию
(объект — гаструлы или нейрулы шпорцевой лягушки)

	Концентрация		Удельная радиоактивность			Заклю-	Гибель/урод- ство, %
Испыты ваемое вещество	мг/л	ДОЛИ от пдк	DPM имп/мин штук		о-к* к ,	ПО экспрес сному биотести рованию	через [ ч	суммарно за 2 суток
		ДОЛИ от пдк	опыт	конт роль	%	ПО экспрес сному биотести рованию	(сутки)	суммарно за 2 суток
Вода	—	—
Медный купорос	0,04 0,004 0,0004	10 пдк пдк 0,1 пдк
Янтарная кислота	0,1 0.01	юпдк пдк
Соляровое масло	0.01 0,001	пдк 0,1 пдк
Хлорис тый литий	1,5 0.15 0,015	юпдк пдк 0,1 пдк
дат	следы	(К,)**
Атразин	0,1 0.005 0,0005	к, пдк 0.1ПДК

Приготовить и проанализировать пробы по стандартной методике (см. лабораторную работу № 14, пп. 5—8). Для установления корреляции изменений уровня СР-реак- ций при адаптационной стрессовой реакции зародышей амфибий в присутствии токсикантов с более поздними нарушениями их жизнеспособности часть подопытных зародышей оставить в растворе токсиканта в течение 2 суток. За этот срок дважды подсчитать процент аномальных и погибших зародышей в каждом опыте. Результаты занести в табл. 15.1.

Мелехова О. П., Коссова Г. В. Способ определения эмбриотоксичности химических соединений и их комплексов. — Патент № 2073868 от 20.02.1997.
Дабагян Н.В. Объекты биологии развития / Н. В.Дабагян, Л. А. Слепцова. — М., Наука, 1975.

<< | >>

Источник: О. П. Мелехова, Е. И. Егорова, Т. И. Евсеева. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование : учеб, пособие для сгуд. высш. учеб, заведений. 2007

Еще по теме Лабораторная работа №15. ИССЛЕДОВАНИЕ НАРУШЕНИЙРАЗВИТИЯ ЭМБРИОНОВ ВОДНЫХ ЖИВОТНЫХ С ПРИМЕНЕНИЕММЕТАБОЛИЧЕСКОГО КРИТЕРИЯ (Методика разработана О. П. Мелеховой и Г. В. Коссовой):

- Геоэкология - Основы экологии - Экологический мониторинг - Экология животных - Экология насекомых - Экология почв и агроэкология - Экология птиц - Экология рыб -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -