Лабораторная работа №14. МЕТОД ПРИВИТОЙ СОПОЛИМЕРИЗАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТА ДАФНИИ МАГНА (Методика разработана О. П. Мелеховой и Г. В. Коссовой)

В данной лабораторной работе предлагается освоить метод прогностической оценки экологического качества воды по изменению уровня окислительного метаболизма у дафний, живущих и размножающихся в условиях антропогенного загрязнения.

В качестве теста используется реакция привитой сополимери- зации (ПС) меченного по углероду индикатора акриламида |4С.
Принцип метода состоит в том, что при введении в живой организм индикатора-мономера в клетках происходит полимеризация этого ненасыщенного соединения, инициируемая метаболическими свободными радикалами, при этом образуются сополимеры, у которых цепи меченого полимера соединяются с биополимерами (белками, фосфолипопротеидами). Небольшие молекулы водорастворимого мономера легко проникают в живую клетку и достаточно быстро вымываются из нее, тогда как сополимеры, по-видимому, выключаются из нормального метаболизма и при длительной инкубации накапливаются в клетках объекта. Это обусловливает высокую чувствительность метода. Меченые сополиме

ры, концентрация которых в клетках биологического объекта пропорциональна количеству образующихся во время инкубации свободных радикалов, могут быть затем обнаружены методом радиометрии. Общая чувствительность метода существенно повышается при использовании современных жидкостных сцинтилляционных счетчиков.
Концентрация свободных радикалов в клетках и тканях характеризует уровень окислительно-восстановительных реакций, так как свободные радикалы (СР) являются промежуточными продуктами этих реакций. В клеточном метаболизме у животных наиболее распространены CP-реакции в ферментативных цепях окисления митохондрий и микросом, возможно, в процессе генерации АТФ, а также при неферментативном окислении (значительная часть СР в живой клетке образуется при перекисном окислении мембранных липидов). В ряде работ показано, что концентрация СР в тканях коррелирует с их функциональной активностью и является весьма чувствительным показателем различного рода повреждений клеток и тканей.
Тест-объектом для оценки степени загрязнения пресных водоемов методом ПС может быть представитель пресноводных биоценозов рачок Daphnia magna, широко распространенный в прибрежной зоне стоячих или медленно текучих водоемов. Вся процедура определения занимает не более двух суток (поэтому способ может считаться экспрессным) и проводится в 2 этапа. Первый этап — отбор проб — проводится в полевых условиях с использованием обычной лабораторной посуды и шприца для введения индикатора — раствора меченого акриламида. Концентрация и активность меченого вещества столь мала (0,1 % в воде при активности рабочего раствора 37 кБк/мл), что нет необходимости в создании особых условий безопасности для работы. Нельзя лишь допускать попадания раствора в рот или на поверхность слизистых глаза, а также следует тщательно собирать в контейнер остатки раствора и отходы опыта и своевременно доставлять их для уничтожения в лабораторию. Пробы отбираются в специальные флаконы для сцинтилляционного счета. На втором этапе работы требуется жидкостный сцинтилляционный счетчик, т.е. исследование должно завершаться в лаборатории.
Цель работы — освоение метода экспресс-оценки качества среды обитания живых организмов по изменению интенсивности СР- реакций у дафний, типичных для ранних стадий патологических процессов.
Оборудование, материалы и реактивы:
тест-объектами могут служить различные гидробионты (дафнии, эмбрионы амфибий и рыб, морские беспозвоночные и т. п.). Чашки Петри, микродозатор, мерные цилиндры (на 10 мл и более), пипетки, контейнеры (с притертой пробкой) для хранения раствора индикатора и сбора отходов, кювета, ножнины, пиннеты, весы аналитические, флаконы для сцинтилляционного счета, термостат, сцинтилляционный счетчик для измерения радиоактивности; 70 %-й спирт; 0,1 %-й раствор индикатора акриламида 14С (с активностью 37кБк/мл)[†††]; концентрированная НСЮ4 трис, сцинтилляционный раствор Брея; СиС12.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ Приготовить исследуемые растворы. В качестве исследуемых растворов в данной задаче используются растворы СиС12 различной концентрации относительно предельно допустимых значений — от 0,1 до 100 ПДК (табл. 14.1). По 10 дафний поместить в сосуды с 20 мл инкубационной среды — тестируемых проб и чистой воды (контроль).

В каждый стакан добавить индикатор. По истечении 1,5 ч отмыть рачков тремя порциями чистой воды и, обсушив на фильтрованной бумаге, поместить по 5—6 шт. во флаконы для сцинтилляционного счета. К каждой пробе добавить по 0,4 мл концентрированной НСЮ4 и поставить в термостат до полного растворения пробы (на 10— 15 ч) при 56 °С. Затем к каждой пробе добавить по 1 мл 1,5М триса и по 10 мл сцинтилляционного раствора Брея. Радиоактивность проб определить методом жидкостной сцинтилляции, учитывая, что включение метки пропорциональна уровню радикальной полимеризации. Для оценки токсичности исследуемых растворов сравнить уровень радикальной полимеризации в опытных и контрольных пробах. Это достигается сопоставлением их радиоактивности (в пересчете на 1 дафнию). Эксперимент ставится в трех повторностях. Достоверность различия опытных и контрольных выборок оценить стандартными статистическими методами.
Внимание! Индивидуальные различия в интенсивности СР-ре- акций у интактных особей не превышают 20 %, а сдвиг среднего значения уровня CP-реакций в опытной выборке на 30—40% по отношению к контролю соответствует началу патологического процесса.
Форму таблицы для представления результатов см. в лабораторной работе N° 15.

Предельно допустимые концентрации загрязняющих веществ
для рыбохозяйственного назначения

Загрязняющее вещество	Предельно допустимая концентрация, мг/л
Аммоний солевой (NH4+)	0,5
Нитрат-ион (NO3-)	40
Нитрат-ион (N02-)	0,08
Нефть и нефтепродукты	0,05
Фенолы	0,001
СПАВ анионактивные	0,1
Железо (Fe3+)	0,5
Медь (Си2+)	0,001
Цинк (Zn2+)	0,01
Хром (Сг2+)	0,5
Хром (Сг6*)	0,001
Никель (Ni2+)	0,01
Кобальт (Со2+)	0,01
Свинец (РЬ2+)	0,03
Мышьяк (As3+)	0,055
Ртуть (Hg2+)	0,0005
Кадмий (Cd2+)	0,005
Марганец (Мп2+)	0,01
Фтор (F-)	1,5
Цианиды (CN-)	0,05
Родианиды (CNS~)	0,1
Метилмеркаптаны	0,002
Бензол	0,5
Метанол	0,1
Формальдегид	0,01
Калий (катион) (К+)	50,0
Кальций (катион) (Са2+)	180,0
Магний (катион) (Mg2+)	40,0
Натрий (катион) (Na+)	120,0
Сульфаты (анион) (S04~)	100,0
Хлориды (анион) (С1~)	300,0

Козлов Ю. П. Привитая сополимеризация как метод исследования свободных радикалов в биологических системах. — М.: Изд-во МГУ, 1970.
Мелехова О. П. Биоиндикация стоков промышленного производства целлюлозы методом радикальной полимеризации / О. П. Мелехова [и др.] // НДВШ, Биологические науки, 1990. — № 5.
Мелехова О.П. Экспресс-метод биотестирования качества воды по метаболическому критерию / О.П.Мелехова [и др.]. — М.: РГОТУПС, 2000.
Мелехова О. П., Бузинова Н. С, Колосова Л. В., Коссова Г. В. — Авт. свид. «Способ биоиндикации загрязнений водной среды» № 1546904, 1988.
Мелехова О.П., Коссова Г. В. — Патент № 2073868, 1997.
НонхибелД. Радикалы / Д.Нонхибел [и др.]. — М.: Мир, 1982.

<< | >>

↑

Источник: О. П. Мелехова, Е. И. Егорова, Т. И. Евсеева. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование : учеб, пособие для сгуд. высш. учеб, заведений. 2007

Еще по теме Лабораторная работа №14. МЕТОД ПРИВИТОЙ СОПОЛИМЕРИЗАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТА ДАФНИИ МАГНА (Методика разработана О. П. Мелеховой и Г. В. Коссовой):

- Геоэкология - Основы экологии - Экологический мониторинг - Экология животных - Экология насекомых - Экология почв и агроэкология - Экология птиц - Экология рыб -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -