Лабораторная работа №16. БИОДИАГНОСТИКА ПОЧВПО ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ (Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой по методическим разработкам Л. В.Лысак)

Почвенно-энзимологические методы позволяют определять не количественное содержание ферментов в почве, а активность ферментов, находящихся преимущественно в адсорбированном (иммобилизованном) состоянии на поверхности почвенных коллоидов и частично в почвенном растворе.

Принцип метода определения активности почвенных ферментов основан на учете количества переработанного в процессе реакции субстрата или образующегося продукта реакции в оптимальных условиях температуры, pH среды и концентрации субстратов.
Сущность метода определения активности почвенных ферментов почвы заключается в следующем: навеску почвы насыщают антисептиком (толуолом), добавляют буферный раствор со значением pH, оптимальным для данного фермента, и определенное количество субстрата. Реакционную смесь выдерживают в термостате в течение определенного времени, и после этого проводят количественный учет продуктов реакции. Активность фермента выражают в количествах переработанного субстрата или образующегося продукта реакции в течение определенного промежутка времени и рассчитывают на единицу веса почвы или гумуса.
Для корректировки результатов ставят следующие контроли:
1) почва, стерилизованная сухим жаром при 180 °С в течение 3 ч; 2) нестерильная почва без субстрата (Н20); 3) субстрат без почвы со всеми реактивами.
В соответствии с рекомендацией Международного биохимического союза по ферментам за единицу измерения принята стандартная ферментная единица (Е): 1Е соответствует такому количеству фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение 1 мкМ субстрата в 1 мин. При определении почвенных ферментов это количество рассчитывают на единицу веса (например, на 1 г) почвы.

Методика отбора почвенных образцов определяется поставленными перед исследователем задачами. Во всех случаях образцы почв должны наиболее полно характеризовать исследуемую площадь (см. гл. 3).
Образцы высушивают непосредственно после взятия в полевых условиях до воздушно-сухого состояния, обязательно в тени. Перед анализами почву тщательно очищают от корней растений и других растительных остатков и камней. Высушенные пробы растирают и просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм. Хранить почву перед анализом в холодильнике.
Ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз, катализируют окислительно-восстановительные реакции, играющие ведущую роль в биохимических процессах в клетках живых организмов, а также в почве. Наиболее распространены в почвах такие оксидоредуктазы, как каталаза и дегидрогеназы, активность которых является важным показателем генезиса почв.
Каталаза разлагает на воду и молекулярный кислород ядовитую для клетки перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания живых организмов в результате различных биохимических реакций окисления органических веществ.
Активность каталазы определяется газометрическим методом по объему выделившегося кислорода, основанным на измерении скорости разложения перекиси водорода при ее взаимодействии с почвой.
Дегидрогеназы — ферменты, которые участвуют в процессе дыхания, отщепляя водород от окисляемых субстратов. Одни дегидрогеназы переносят водород непосредственно на молекулярный кислород, другие — на какие-либо акцепторы, например на хи- ноны, метиленовую синь.
Для определения активности дегидрогеназы в качестве акцептора водорода применяют бесцветные соли тетразолия (2,3,5-три- фенилтетразолий хлористый (ТТХ), которые восстанавливаются в красные соединения формазана (трифенилформазан (ТФФ).
Гидролазы осуществляют реакции гидролиза разнообразных сложных органических соединений, действуя на различные связи: сложноэфирные, глюкозидные амидные, пептидные и др. К этому классу относятся ферменты инвертаза, уреаза и др., активность которых является важным показателем биологической активности почв и широко используется для оценки антропогенного воздействия.
Инвертаза действует на p-фруктофуранозидную связь в сахарозе, рафинозе, стахиозе и производит расщепление сахарозы на эквимолярные количества глюкозы и фруктозы.
Фотоколориметрическое определение активности инвертазы основано на учете восстанавливающих сахаров, образующихся при расщеплении сахарозы.
Разложение органических азотистых соединений осуществляется при непосредственном участии внеклеточных ферментов. Образующийся при уреазной активности аммиак служит источником питания растений.
Уреаза катализирует гидролиз мочевины. Конечными продуктами гидролиза являются аммиак и углекислый газ. Мочевина попадает в почву в составе растительных остатков, навоза и как азотное удобрение; она образуется также в самой почве в качестве промежуточного продукта в процессе превращения азотистых органических соединений — белков и нуклеиновых кислот.
Описываемые методы определения ферментов даны по Ф. X. Ха- зиеву.
Цель работы — определение биологической активности почв на разном удалении от дороги по четырем ферментным системам: дегидрогеназам, каталазе, инвертазе, уреазе.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
Определение каталазной активности Оборудование и реактивы:
система для газометрии (рис. 16.1); 10 %-й раствор Н202; СаСОэ. Навеску просеянной почвы 1 г внести в колбу на 100 мл, добавить 0,5 г СаС03. На дно осторожно поставить с помощью пинцета маленький стаканчик с 1,7 мл 10 %-го раствора перекиси водорода. Навеску почвы смочить 4 мл дистиллированной воды. Колбу плотно закрыть каучуковой пробкой с трубкой, соединенной с бюреткой толстостенным каучуком через тройник, снабженный зажимом. Бюретка сообщается с грушей. Бюретка и груша заполнены водой. Уровень воды в них уравновешивают и грушу закрепляют на определенной высоте. Начало опыта отметить по секундомеру в момент, когда сосудик с перекисью водорода опрокинут, и вслед за этим встряхнуть содержимое колбы. Взбалтывание смеси следует продолжать во все время опыта, не касаясь непосредственно дна колбы руками. Выделяющийся кислород вытесняет из бюретки воду, уровень которой отмечают. Количество выделившегося молекулярного кислорода учитывают в течение 1 мин при температуре 18 — 20 °С. Активность каталазы выражают в объеме (см3) кислорода, выделившегося на 1 г почвы в минуту. Ошибка определения до 5%. Аналогичные процедуры проделать со всеми образцами почв. По табл. 16.1 оценить степень насыщения исследуемых почв каталазой.

Рис. 16.1. Установка для газометрического определения каталазной ак-
тивности в почвенных образцах:
1 — колба, 2 — бюретка, 3 — переходник, 4 — груша с водой
Таблица 16.1
Шкала для оценки степени обогащенности почв ферментами

Степень обогащенности почв	Каталаза, 02см3Д за 1 мин	Дегидрогеназы, мг ТФФна 10 г за 24 ч	Инвертаза, мг глюкозы на 1 г за 24 ч	Уреаза, мг nh4, на 10 г за 24 ч	Фосфотаза, мг Р2Оз на 10 г за 1 ч
Очень бедная	lt; 1	lt;1	lt;5	lt;3	lt;0,5
Бедная	1-3	1-3	5-15	3-10	0,5-1,5
Средняя	3-10	3-10	15-50	10-30	1,5-5,0
Богатая	10-30	10-30	50-150	30-100	5-15
Очень богатая	gt;30	gt;30	gt; 150	gt; 100	gt;15

Определение дегидрогеназной активности
Оборудование, материалы и реактивы:
фотоколориметр; миллиметровая бумага; 0,1М раствор глюкозы; 1 %-й раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (1I X); СаС03; этиловый спирт; трифенилформазан (ТФФ). Навески воздушно-сухой почвы по 1 г из каждого образца поместить в пробирки, добавить по 10 мг (на кончике шпателя) СаСОэ, по 1 мл 0,1М раствора глюкозы и по 1 мл 1%-го раствора ТТХ; содержимое каждой пробирки тщательно смешать.

Пробирки поместить в анаэростат и откачать воздух насосом при разрежении 10—12 мм рт. ст. в течение 2—3 мин. Затем инкубировать при 30 °С в течение 24 ч. По истечении времени инкубации содержимое пробирок экстрагировать в 3 — 4 приема 25 мл этилового спирта. Для этого небольшой, объем спирта внести в пробирку и встряхивать в течение 5 мин до появления красной окраски. Дать отстояться и надпочвенную жидкость профильтровать через бумажный фильтр. Добавить в пробирку следующую порцию спирта. Полученный окрашенный раствор формазана колориметри- ровать на ФЭКе с синим светофильтром (500—600 нм). Количество формазана в миллиграммах рассчитать по стандартной кривой. Для этого приготовить стандартный раствор формазана в этиловом спирте в концентрации 0,1 мг в 1 мл. Рабочие растворы для составления кривой приготовить путем разведений стандартного раствора (примерно 5 точек). Стандартную кривую построить на миллиметровой бумаге в системе: оптическая плотность при длине волны 500— 600 нм — концентрация формазана в спирте. Активность дегидрогеназы (А) выражают в миллиграммах ТФФ на 10 г почвы за сутки по формуле

где V — общий объем фильтрата, 25 мл; 10 — пересчетный коэффициент веса почвы, г; v — произведение объемов субстрата и реагента, 1 мл; А — количество ТФФ, полученное по калибровочной кривой, мг/мл. Ошибка определения — до 8 %. По табл. 16.1 оценить степень насыщения исследуемых почв дегидрогеназой.
Определение инвертазной активности Оборудование и реактивы:
фотоколориметр; 5%-й раствор сахарозы; ацетатный буфер (pH 4,7); толуол; раствор Феллинга: а — 40 г CuS04- 5Н20 растворяют в воде и доводят до 1 л, фильтруют через бумажный фильтр, б — 200 г сегнетовой соли (C4H406KNa-4Н20) растворяют в дистиллированной воде, прибавляют 150 г КОН и доводят до 1 л. В колбы вместимостью 50 мл поместить по 5 г каждого образца почвы, добавить по 10 мл 5%-го раствора сахарозы, 10 мл ацетатного буфера (pH 4,7) и 5 — 6 капель толуола. Колбы закрыть пробками, встряхнуть, поместить в термостат при температуре 30 °С на 24 ч и периодически встряхивать их. После инкубации содержимое колб отфильтровать в мерные колбы на 25 мл. Довести до метки. Из фильтратов взять по 6 мл в большие пробирки, добавить по 3 мл раствора сегнетовой соли и 3 мл раствора сернокислой меди, хорошо перемешать и кипятить на водяной бане 10 мин. Получается красный осадок. Пробирки с раствором охладить в воде, содержимое отфильтровать в большие пробирки. Прозрачный фильтрат колориметри- ровать на ФЭК, используя светофильтр с длиной волны 630 нм, ширина кюветы 1 см. Для получения калибровочной кривой приготовить стандартный раствор: 6 мг глюкозы в 1 мл. Разведением приготовить серию растворов. Фотоколориметрировать и построить кривую: оптическая плотность — концентрация глюкозы в 1 мл. Активность инвертазы (X) выражают в милли1раммах глюкозы
на 1 г почвы за 24 ч по формуле
где А — количество глюкозы, полученное по калибровочной кривой из оптической плотности, мг/мл; т — навеска почвы, 5 г; V — общий объем фильтрата, 25 мл; v — объем фильтрата, взятого для анализа, 6 мл. Ошибка определения — до 5 %. По табл. 16.1 оценить степень насыщения исследуемых почв инвертазой.
Определение уреазной активности почв Оборудование и реактивы:
фотоколориметр; 2%-й раствор мочевины в фосфатном буфере (pH 6,7); 50%-й раствор сегнетовой соли; 50%-й раствор СС13СООН (трихлоруксусная кислота); 1%-й раствор КС1; реактив Несслера; стандартный раствор NH4C1. 1 По 5 г воздушно-сухой почвы поместить в колбы емкостью 100 мл, прилить по 20 мл 2%-го раствора мочевины в фосфатном буфере (pH 6,7) и по 200 мкл толуола. Колбы плотно закрыть и поместить в термостат при температуре 37 °С на 4 ч. После экспозиции прилить по 1 мл 50%-го раствора трихлор- уксусной кислоты. Для вытеснения из почвы поглощенного аммиака добавить по 50 мл 1 н. раствора хлористого калия. Содержимое колб отфильтровать. По 2 мл фильтрата поместить в мерные колбы объемом 50 мл, развести водой до 30 мл, затем прилить по 2 мл 50%-го раствора сегнетовой соли и по 2 мл реактива Несслера. Колбы долить водой до метки, перемешать и окрашенный раствор колориметрировать при длине волны 400 нм. Содержание аммиака в фильтрате рассчитать по стандартной
кривой. Для этого приготовить стандартный растворв кон
центрации 0,005 мг N—NH4 в 1 мл. Сделать серию разведений. Построить калибровочную кривую. Активность уреазы (X) выражают в миллиграммах N—NH4
на 1 г почвы за 4 ч по формуле:
где А — содержание аммиака в фильтрате, полученное по калибровочной .кривой, мг/мл; V — общий объем фильтрата, 50 мл; т — навеска почвы, 5 г. По табл. 16.1 оценить степень насыщения исследуемых почв уреазой.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Приготовление ацетатных буферных смесей
Для области pH 3,6—5,6 (0,01 М).
Основные растворы: А — 0,2 М уксусная кислота (11,55 мл уксусной кислоты в 1л воды); Б - 0,2 М раствор ацетата натрия (16,4 г C6H302Na или 27,2 г C6H302Na • ЗН20 в 100 мл воды):
х мл раствора А + у мл раствора Б и разбавить водой до 1 л.

X	У	pH	X	У	pH	X	У	pH
46,3	3,7	3,6	30,5	19,5	4,4	10,5	39,5	5,2
44,0	6,0	3,8	25,5	24,5	4,6	8,8	41,2	5,4
41,0	9,0	4,0	20,0	30,0	4,8	4,8	45,2	* 5,6
36,8	13,2	4,2	14,8	35,2	5,0

Приготовление фосфатной буферной смеси
Для области pH 5,7—8,0 (0,1 М).
Основные растворы: А — 0,2 М раствор однозамещенного фосфата натрия (27,8 г NaH2P04 в 1л); Б — 0,2 М раствор двузаме- щенного фосфата натрия (53,65 г Na2HP04-7H20 или 71,7 г Na2HP04 • 14Н20 в 1 л):

X	У	pH	X	У	pH	X	У	pH
93,5	6,5	5,7	68,5	31,5	6,5	23,0	77,0	7,3
92,0	8,0	5,8	62,5	37,5	6,6	19,0	81,0	7,4
90,0	10,0	5,9	56,5	43,5	6,7	16,0	84,0	7,5
87,7	12,3	6,0	51,0	49,0	6,8	13,0	87,0	7,6

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Звягинцев Д. Г. Биология почв / В. Г. Звягинцев [и др.]. — М.: Изд-во МГУ, 2005.
Микроорганизмы и охрана почв / под ред. Д. Г. Звягинцева. — М.: Изд- во МГУ, 1991.
Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. Д. Г. Звягинцева. — М.: Изд-во МГУ, 1991.
Практикум по агрохимии / под ред. В. Г. Минеева. — М.: Изд-во МГУ, 2001.
Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. — М.: Наука, 1991.

<< | >>

Источник: О. П. Мелехова, Е. И. Егорова, Т. И. Евсеева. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование : учеб, пособие для сгуд. высш. учеб, заведений. 2007

Еще по теме Лабораторная работа №16. БИОДИАГНОСТИКА ПОЧВПО ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ (Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой по методическим разработкам Л. В.Лысак):

- Геоэкология - Основы экологии - Экологический мониторинг - Экология животных - Экология насекомых - Экология почв и агроэкология - Экология птиц - Экология рыб -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -