Лабораторная работа №21. ЧАСТОТА ХРОМОСОМНЫХАБЕРРАЦИЙ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА (.Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)

Цитогенетические тесты in vitro направлены на то, чтобы продемонстрировать индукцию хромосомных нарушений (аберраций) в культивируемых клетках. Обычно в этих тестах клетки изучаются на стадии метафазы.
В норме хромосомы по форме можно разделить на три группы (рис. 21.1): акроцентрические (галочковидные, у которых одно плечо очень маленькое) — на рисунке хромосомные пары 13, 14, 15 — средние, 21, 22 — мелкие; субметацентрические (неравноплечие) — хромосомные пары 2 — самые крупные, 4, 5 — крупные, 6—12 — средние, 16 — 18 — мелкие; метацентрические (равноплечие) — хромосомные пары 1 — самые крупные, 3 — крупные, 19, 20 — мелкие.

Рис. 21.1. Кариотип человека внорме

Хромосомные аберрации являются крупным повреждением хромосом и, следовательно, ДНК, поэтому кластогенные факторы (физический или химический фактор классифицируется как кластоген, если он вызывает увеличение числа разрывов хромосом по сравнению с контрольным образцом) должны рассматриваться как потенциально опасные. Клетки с видимыми хромосомными аберрациями, по всей вероятности, не способны к выживанию, но в клетках, которые кажутся неповрежденными, может происходить репарация ДНК и, если этот процесс протекает с ошибками, возможно возникновение мутаций. Отдельные виды хромосомных нарушений, такие как некоторые делеции и перестройки (транслокации, инверсии), могут и не вызывать летального эффекта. Сравнительно высокий уровень хромосомных нарушений у людей свидетельствует о возможной роли изменений хромосом в популяциях человека.
Хромосомные аберрации анализируются в метафазах митотического деления клеток пролиферирующих тканей, например костного мозга лабораторных животных. Данный тест имеет широкое применение, и многие регламентирующие органы, принимающие решения в области охраны окружающей среды, придают ему особое значение. Поскольку он проводится на целом организме животных, то лишен очевидных недостатков, связанных с применением искусственных систем метаболической активации in vitro.
Хромосомные аберрации возникают в результате нарушений в ДНК, приводящих к разрыву двойной спирали. При изучении процессов репарации ДНК установлено много видов первичных нарушений: одно- и двунитевые разрывы, повреждения оснований, сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок, алкилирование оснований или фосфатных групп, тиминовые димеры, сайты, лишенные пуринов и пиримидинов. Эти нарушения могут либо исправляться, либо трансформироваться, при этом либо восстанавливается оригинальная последовательность оснований, либо образуются хромосомные аберрации и/или генные мутации.
Часто для исследования хромосомных аберраций используются лимфоциты периферической крови человека (мононуклеарные лейкоциты). Лимфоциты не способны к делению в культуре, но этот процесс можно стимулировать путем обработки каким-либо митогеном, например фитогемагглютиннином (ФГА). Культуру получают из образца свежеполученной крови и проводят культивирование на протяжении нескольких циклов делений. Первой метафазы после внесения митогена клетки достигают не ранее чем через 36 —40 ч, после чего они делятся приблизительно каждые 18 ч.
После введения в культуру клеток тестируемого вещества клетки выращивают в течение одного или двух клеточных циклов с тем, чтобы большинство клеток достигло первой метафазы после

обработки, а затем проводят фиксацию. Перед фиксацией добавляют вещество, блокирующее образование веретена деления, например колхицин, для того чтобы остановить деление клеток на стадии метафазы. Клетки обрабатывают гипотоническим раствором, например 0,56% = М (075М) хлористым калием, после чего фиксируют свежеприготовленной смесью этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (в соотношении 3:1).

Затем клетки окрашивают по Гимзе, орсеином или другим красителем для хромосом и изучают под микроскопом.
Принцип метода основан на образовании хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека под влиянием мутагенов и канцерогенов.
Цель работы — обнаружение в готовых препаратах лимфоцитов крови человека хромосомных аберраций различного типа, образованных под действием различных мутагенов и канцерогенов.
Оборудование и материалы:
микроскопы световые; готовые препараты лимфоцитов периферической крови человека с хромосомными аберрациями разного типа; иммерсионное масло; вата, спирт для протирки оптики.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ Получить у преподавателя препараты лимфоцитов крови человека с хромосомными аберрациями различных типов. Обнаружить и зарисовать в рабочую тетрадь все типы хромосомных аберраций. Если известны дозы или концентрации мутагенов и канцерогенов, то построить кривую «доза—эффект». Проанализировать дозовую (концентрационную) зависимость.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Культивирование лимфоцитов
Реактивы: 77%-й МЕМ (6,16 мл на 1 флакон Карреля); 20%-й ТС (1,6 мл на 1 флакон Карреля); 1%-е I-глютамин, пенициллин + + стрептоцид (по 0,08 мл на 1 флакон Карреля); 1%-й ФГА (0,15 мл на 1 флакон Карреля). [MEM — minimum essential medium — минимальная питательная среда; ТС — телячья сыворотка; ФГА — фитогемаглютинин.] На I мл цельной крови добавить 0,1 мл раствора гепарина (1 мл гепарина + 19 мл стерильного физиологического раствора). Инактивация сыворотки проводится на водяной бане при 56 °С в течение 30 мин. Культивирование. Процесс длится 48 ч при 37 °С. За 2,5 ч до его окончания добавить колцемид 0,2 мг/мл: на 1 флакон с кол- цемидом добавить 10 мл дистиллированной воды — это рабочий раствор. На 1 флакон Карреля с культурой добавить 0,17 мл рабочего раствора колцемида.
После инкубации пробирки с культурой центрифугировать при 1 000 об/мин в течение 12—15 мин. Снять надосадочную жидкость, оставляя слой 2—3 мм над осадком. Осадок перемешать, в несколько приемов небольшими порциями добавить гипотонический раствор КС1 — 0,075М (550 мг КС1 + 110 мл дистиллированной воды). Довести объем до 10 мл, на 13 —15 мин поместить в термостат или водяную баню. Отцентрифугировать при 1 000 об/мин в течение 12—15 мин, снять надосадочную жидкость. Фиксация. Осадок перемешать, добавить фиксатор маленькими порциями, постоянно помешивая. Состав фиксатора: 3 ч метанола + 1 ч ледяной уксусной кислоты. Довести объем до 7— 8 мл, отцентрифугировать при 1000 об/мин в течение 10—12 мин. Фиксацию повторить еще 2 раза. Оставить осадок примерно 0,4 мл. Приготовление препарата. Фильтровальной салфеткой, сложенной в 6—8 слоев (ее ширина равна ширине стекла), смоченной дистиллированной водой, провести по предметному стеклу, увлажнив поверхность. Микропипеткой (объем 10—20 мкл) набрать суспензию клеток и нанести на стекло, прикасаясь к нему пипеткой. Сверху на суспензию нанести 2 — 3 капли чистого фиксатора. По краям стекла немедленно убрать остатки фиксатора салфеткой. Окраска. Краситель Гимза, 2—4%-й раствор. На 1 кювету берется 158 мл дистиллированной воды, 17,5 мл красителя, 2 мл 5%-го раствора соды. Свежеприготовленной краской красить 10 мин.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. — Женева: Всемирная организация здравоохранения, 1989.
Паушева 3. П. Практикум по цитологии растений. — М.: Агропромиз- дат, 1988.
Биологическая дозиметрия по хромосомным аберрациям в культуре лимфоцитов человека. Методические рекомендации. — Обнинск: ИМР РАМН, 1979.

<< | >>

Источник: О. П. Мелехова, Е. И. Егорова, Т. И. Евсеева. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование : учеб, пособие для сгуд. высш. учеб, заведений. 2007

Еще по теме Лабораторная работа №21. ЧАСТОТА ХРОМОСОМНЫХАБЕРРАЦИЙ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА (.Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой):

- Геоэкология - Основы экологии - Экологический мониторинг - Экология животных - Экология насекомых - Экология почв и агроэкология - Экология птиц - Экология рыб -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -