Лабораторная работа №22. ЧАСТОТА БИНУКЛЕАРНЫХКЛЕТОК С МИКРОЯДРАМИ В КУЛЬТУРЕ ЛИМФОЦИТОВЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ у-ОБЛУЧЕНИЯ {Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)

Микроядерный метод заключается в количественной регистрации микроядер в лимфоцитах периферической крови человека.
Известно, что именно лимфоциты периферической крови сохраняют полученные повреждения в течение длительного времени. Микроядра обнаруживаются в лимфоцитах сразу после первого митоза. Поскольку в обычных условиях лимфоциты представляют собой неделящуюся популяцию, их подвергают ФГА- стимуляции в культуре. Для построения дозовой зависимости кровь облучают in vitro и спустя 72 ч от начала ФГА-стимуляции анализируют.
Подсчитывают обычно 500 бинуклеарных клеток, используя метод цитокинетического блока. Он основан на введении в культуру лимфоцитов цитохолазина-Б, который блокирует разделение цитоплазмы. Блокирование цитокинеза ведет к накоплению в культуре бинуклеарных клеток, которые удобно анализировать на возможность присутствия в них микроядер.
Для правильного анализа клеток с микроядрами следует учитывать ряд правил. Микроядра имеют обычно округлую или овальную форму и обладают типичной ядерной окраской. В цитоплазме одной бинуклеарной клетки может присутствовать одно микроядро и более. Большинство микроядер по размеру значительно меньше основного ядра (меньше половины). Регистрировать следует те микроядра, между которыми и основным ядром четко выявляется ядерная мембрана.
В научных исследованиях некоторых лабораторий показано, что при дозах облучения от 1 до 4—5 Гр количество микроядер в клетках увеличивается линейно для всех видов излучений. При дозах от 0,05 до 2 Гр выход микроядер может быть описан линейно-квадратичной зависимостью, хотя в диапазоне доз 0,05—0,1 Гр имеется плато (дозонезависимый участок).
С помощью микроядерного теста можно реконструировать дозу, полученную человеком ранее. Для этого предлагается пользоваться калибровочными таблицами, полученными в лаборатории при использовании венозной крови клинически здоровых доноров в возрасте 20 — 35 лет. Лимфоциты облучают в дозах от 0,05 до 2 Гр. Данные калибровочной кривой представлены в табл. 22.1.
Дозовая зависимость, полученная при образовании бинуклеарных клеток, аппроксимируется линейно-квадратичной функцией
У= 0,029 + 0,111 • D + 0,011 ¦ D2,              (1)
где Y — количество микроядер на одну двуядерную клетку; D — доза облучения.
Построив калибровочную кривую и подсчитав количество микроядер в клетках лимфоцитов исследуемой крови, можно рассчитать дозу, полученную человеком.
Таблица 22.1
Частота бинуклеарных (БН) клеток с микроядрами (МЯ) после у-облучения (по М.А.Анкиной, 1991)

Доза, Гр	Частота МЯ в БН клетках, %	Частота БН клеток с МЯ на 100 клеток
0	0,9 ±0,1	0,9 ±0,1
0,05	1,3±0,1	1,2 ±0,1
од	1,4 ±0,1	1,3 ±0,1
0,2	1,8 ±0,1	1,8 ±0,1
0,3	3,0 ± 0,2	2,8 ± 0,2
0,4	3,7 ±0,2	3,3 ±0,2
0,5.	4,8 ±0,1	4,4 ±0,2
1	10,2 ±0,6	9,2 ± 0,5
2	26,7 ± 1,2	22,7 ± 1,0

Если в лаборатории нет условий для построения калибровочной кривой, можно пользоваться кривыми, полученными в других лабораториях.
Принцип метода заключается в образовании микроядер вследствие нарушения распределения генетического материала между дочерними клетками (5 %) или формирующихся из обломков хромосом (до 95 %).
Цель работы — реконструкция дозы облучения, полученной донором, по количеству клеток с микроядрами.
Оборудование и материалы:
микроскоп; препараты лимфоцитов периферической крови с микроядрами после разных доз у-облучения.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ Получить у преподавателя препараты лимфоцитов с микроядрами, образованными при у-облучении разными дозами. По табл. 22.1 построить калибровочную кривую на миллиметровой бумаге. Найти число бинуклеарных клеток с микроядрами на 500 бинуклеарных клеток. Для расчета дозы, полученной донором, воспользоваться формулой 1. Найти дозу, полученную донором, с помощью калибровочной кривой.

Анкина М.А. Изучение зависимости доза-эффект для частоты бину- кпеарных клеток с микроядрами в культуре лимфоцитов человека после у-облучения / М.А.Анкина, Г.Ф. Михайлова // Радиобиология, 1991. — Т. 31. — Вып.1.
Использование микроядерного теста для индикации прострадиаци- онных эффектов у человека: Метод, рекомендации. — Л.: ЦНИРРИ, 1991.
Almassy Z. The Present stats and Perspectives of micronucleus assay in radiation protection / Z.Almassy {et al.] I I A review. Appl. Radiat. Isoe, 1987 - V. 38. - N 4.

Еще по теме Лабораторная работа №22. ЧАСТОТА БИНУКЛЕАРНЫХКЛЕТОК С МИКРОЯДРАМИ В КУЛЬТУРЕ ЛИМФОЦИТОВЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ у-ОБЛУЧЕНИЯ {Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой):

1. 2.2.4. Изучение условий поддержания и хранения культур М. pachydermatis в лабораторных условиях
2. 3 ГИГИЕНА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
3. СВЕДЕНИЯ О ГЕЛЬМИНТОЗАХ ЛАБОРАТОРНЫХ ГРЫЗУНОВ
4. Лабораторно-полевые ульи для шмелей
5. Организация оплодотворения самок в лабораторных условиях
6.   ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АППАРАТУРЫ В ЛАБОРАТОРНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ  
7.   ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ ТЕСТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВНУТРЕННИХ БОЛЕЗНЕЙ 
8. АДЕНОВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ ОБЕЗЬЯН И ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
9.   ГЛАВА 3 ЛАБОРАТОРНЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ
10. ГЛАВА 19 ГИГИЕНА СОДЕРЖАНИЯ СОБАК, КОШЕК И ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
11. 6.2. Исследование способности животных к символизации (на примере «счета») с помощью лабораторных тестов
12.   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с., 2004
13. Педагогическая работа
14. Учебная работа.
15. Глава 2. Лабораторное оборудование для изучения шмелей: особенности содержания шмелей для исследовательских целей
16. Основы безопасности при работе со шмелями