Лабораторная работа №20. ИСПОЛЬЗОВАНИЕТРАДЕСКАНЦИИ (КЛОН 02) ДЛЯ ОЦЕНКИ МУТАГЕННОГОИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ (Лабораторная работа подготовлена Т. И. Евсеевой и С. А. Гераськиным)

Традесканция принадлежит к семейству коммелиновые (Comme- Чпасеаё). Растение названо по имени английского ботаника и естествоиспытателя начала XIX в. Джона Традесканта — садовника герцога Букингемского и основателя одного из первых ботанических садов, а также Музея естественной истории в Лондоне. Многие виды рода Tradescantia произрастают в природных условиях Северной Америки. Большое число этих видов или их межвидовых гибридов были выведены и собраны в Национальной лаборатории в Брукхейвене (США). Клон 02 (2п - 12), гетерозиготный по окраске цветков, впервые обнаружен в 1958 г. W.V. Brown среди коллекции традесканции, произрастающей на открытом воздухе в Университете штата Техас в Остине.
Данный клон является гибридом между Tradescantia occidentalis и Т. ohiensis. Листья ланцетные, собраны в розетку. Высота цветоноса взрослых растений достигает 40—45 см. Двухстороннее соцветие состоит из нескольких бутонов на разных стадиях развития. При оптимальном режиме выращивания ежедневно в каждом соцветии распускается один цветок, состоящий из трех лепестков и трех чашелистиков, шести тычинок и одного пестика (рис. 20.1).
Дикий тип окраски цветков и клеток волосков тычинок — голубой — является доминантным, розовый — рецессивным (рис. 20.2). Голубая окраска цветков у клона 02 обусловлена пигментом — ан- тоцианом. Окрашивание цветков in vivo начинается за 5 —6 дней до начала цветения после завершения деления терминальных клеток каждого волоска. Окончание деления, таким образом, является сигналом к началу окрашивания клеток волосков. Первыми окрашиваются терминальная или субтерминальная клетки и в последнюю очередь — у основания волоска. За три дня до начала

цветения окрашивание завершается, поэтому бутоны, прошедшие эту стадию к моменту начала воздействия, не должны учитываться в эксперименте.
На каждой тычинке формируется в среднем 45 волосков. Волосок представляет собой меристематические, последовательно расположенные клетки, развивающиеся из одной эпидермальной посредством деления терминальных и субтерминальных клеток. Количество волосков зависит от возраста соцветия и условий окружающей среды. Тычинки последних цветков в старых соцветиях имеют 30 — 32 волоска.
В условиях умеренного климата на открытом воздухе традесканция может произрастать только летом, поэтому ее разводят в теплицах.
Традесканция относится к растениям длительного светового дня, и в условиях высоких широт без специального освещения невозможно круглый год поддерживать ее цветение. Хорошие результаты дает комбинированная подсветка в течение 16—18 ч лампами Reflux 70W и Phillips TLD 36W/840, создающими интенсивность света 12—25 тыс. лк. При указанном режиме растения цветут непрерывно и дают много побегов. Рекомендуемая влажность воздуха — 80 %. Если такие условия создать сложно, учащают полив.
Традесканция размножается преимущественно вегетативно, поэтому ее генетическая изменчивость минимальна. Взрослые растения хорошо развиваются в грунте, состоящем из почвы, песка

и перегноя (1:1:1). Для быстрого размножения можно укоренять черенки и затем высаживать их в приготовленную указанным способом почвенную смесь с добавлением вермикулита. В грунт нельзя вносить навоз или другие свежие органические удобрения, поскольку при этом значительно повышается частота соматических мутаций. Предполагается, что мутагенами в этом случае являются радикалы пестицидов или продукты жизнедеятельности грибов, такие, как нитрозамины. Подкормки производят, заменяя воду при поливе на минеральные питательные среды (например, Кноп- па) или растворы солей гуминовых кислот (например, гумат натрия).
Поскольку спонтанная частота мутаций клеток волосков тычинок традесканции изменяется при колебаниях температуры воздуха, следует контролировать и поддерживать на одном уровне температурный режим в помещении. По нашим данным, при температуре 21 °С частота соматических мутаций в клетках волосков тычинок традесканции (клон 02) составляет (0,09 ±0,04) %, а при 24 °С-(0,12 ±0,04)%.
Традесканция (клон 02) является удобным объектом для изучения действия низких, встречаемых в условиях окружающей среды доз физических факторов, а также концентраций химических мутагенов и токсикантов. В этом отношении к ее достоинствам как тест-объекта можно отнести высокую чувствительность к внешним воздействиям при низких спонтанном уровне мутаций и индивидуальной изменчивости, точность и простоту регистрации маркеров, характеризующих внешнее воздействие.
При оценке мутагенного воздействия факторов применяют методику учета соматических мутаций в клетках волосков тычинок традесканции. Изменение голубой окраски клеток волосков тычиночных нитей на розовую рассматривается как фенотипическое проявление мутации в гетерозиготных по окраске клетках волосков тычинок. В результате деления мутантных клеток в зрелом волоске формируется сектор, включающий одну и более клеток с розовой окраской (см. рис. 20.2). Вероятными механизмами образования розовых мутантных событий считают соматический кроссинговер, предшествующий точковой мутации, замену пар оснований, сдвиг рамки считывания, делеции сегментов хромосом, несущих доминантный ген.
По данным разных авторов, спонтанная частота мутаций для клона 02 изменяется в зависимости от температуры и освещенности в пределах от 0,048 до 0,15 %.
Физические и химические факторы кроме мутагенного оказывают токсическое воздействие, которое оценивают по потере репродуктивной способности клеток. Для определения волосков, остановившихся в росте, необходимо установить число клеток в волоске. Остановка деления клеток может происходить в любом волоске по всей длине тычинки. У ее основания волоски состоят из 23 — 25, в средней части — 22—23 и около верхушки — 12—16 клеток, причем 95 % волосков в верхней части тычинки сформировано 12 (или немногим более) клетками. В связи с этим такие волоски считают нормально развивающимися, а с меньшим количеством клеток (рис. 20.3) — называют низкорослыми (stunted) и учитывают как потерявшие репродуктивную способность.
В настоящее время большой популярностью при оценке состояния окружающей среды пользуется тест на микроядра в материнских клетках пыльцы традесканции, являющийся показателем ге- нотоксичности. Методика детально изложена в работе (Т.Н.Ма, 1982).
С использованием указанных тестов оценивают мутагенность и токсичность веществ, находящихся в газообразном, твердом и жидком состояниях. Для этого применяют не только почвенные культуры растенйй, но и гидропонные, которые незаменимы при биотестировании растворов химических соединений, природных и сточных вод, почвенных вытяжек. Используют как укоренившиеся, так и свежесрезанные черенки с соцветиями. Первые более жизнеспособны и дают большее количество цветков, что удобно в случае долгосрочных экспериментов. Однако при проведении исследований с традесканцией очень важно, чтобы цветки от разных соцветий находились на одинаковой стадии развития в момент обработки, поскольку возраст соцветия влияет на частоту мутаций в клетках волосков тычинок. Указанное требование сложно выполнить, если прибегнуть к технике укорененных черенков, так как корне- образование начинается в разные сроки (от 7-го до 10-го дня и позже). Кроме того, корневая система является своеобразным селективным барьером при поглощении растениями элементов из

Рис. 20.3. Остановившиеся в росте волоски тычинки (на фотографии можно подсчитать число клеток в волоске)

раствора, а следовательно, заранее дискриминирует поступление одного иона по отношению к другому. Это особенно важно учитывать в случае тестирования модельных растворов различных соединений.
В лабораторной работе предлагается освоить методику учета соматических мутаций и потери репродуктивной способности клеток волосков тычинок традесканции (клон 02), применив для биотестирования свежесрезанные черенки с соцветиями.
Цель работы — оценка мутагенности и токсичности проб природных вод (или почв) из районов с разным по характеру и уровню техногенным загрязнением.
Примечание. Учет нарушений в волосках тычинок традесканции проводят ежедневно в течение 15—17 дней, поэтому целесообразнее обучить студентов данной методике во время прохождения практики на биостанциях.

Оборудование и материалы:
цветущие растения традесканции (не менее 3 черенков на каждый вариант опыта); пробы воды (объемом не менее 500 мл); пробирки (объем 50 мл); штатив; предметные стекла; пинцет; препаровальная игла; лезвие; вазелиновое масло; бинокулярная лупа МБС-10; компрессоры с отводящей системой (при наличии).
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
Подготовка проб и растений к эксперименту Отфильтрованную через фильтровальную бумагу пробу воды разлить в три установленные в штативе пробирки. Объем воды во всех пробирках должен быть одинаковым (желательно не менее 25 мл). Пробы воды можно отобрать вблизи дорог или промышленных предприятий из поверхностных водоемов — ручьев, рек и т. п. При возможности лучше протестировать пробы не менее чем в трех повторностях. В следующие три пробирки разлить дистиллированную воду (контроль) в том же объеме (по 25 мл на пробирку). Еще три пробирки заполнить раствором стандартного мутагена (положительный контроль), например 1 мМ раствором малеинового гидразида. Срезать девять черенков традесканции с соцветиями, в которых распустился первый цветок. Длина черенка — 20 см от соцветия. Распределить по одному черенку на каждую пробирку. Зафиксировать время начала эксперимента. Через 24 ч (время воздействия регулируется в зависимости от степени токсичности образца и целей эксперимента) все растения перенести в чистые пробирки со свежей дистиллированной водой. На четвертый день от начала эксперимента начать анализ соматических мутаций и потери репродуктивной способности клеток волосков тычинок.
Подготовка препаратов для микроскопических исследований
Распустившийся цветок, время жизни которого ограничено несколькими часами, срезают утром. Аккуратно отворачивают лепестки и, зажав их указательным и большим пальцами левой руки, срезают тычинки, держа лезвие в правой руке. Тычинки необходимо срезать по одной у самого основания, не повреждая клетки волосков. Затем тычинки кладут на заранее приготовленное предметное стекло в вазелиновое масло (рис. 20.4). Следует использовать небольшое количество вазелинового масла, чтобы препарат не «плавал» в нем, иначе волоски сложно равномерно распределить по обеим сторонам тычинки.
Настроить бинокулярную лупу обычным способом. Используя увеличение не более 10x4 и матовый фильтр, начать анализ препаратов. Левая рука при этом находится на винте настройки изображения, а в правой экспериментатор держит препаровальную иглу и с ее помощью при необходимости поправляет волоски тычинок.
Клетки волосков имеют голубую окраску, поэтому трудностей с распознаванием розовых мутантных клеток (секторов) не возникает. Одна розовая клетка или сектор (несколько идущих подряд розовых клеток, не разделенных голубыми) регистрируются как одно мутантное событие.
В каждой тычинке внимательно просматривают волоски и те из них, которые образованы менее чем 12 клетками, учитывают как укороченные {stunted). Когда все указанные нарушения учтены, подсчитывают количество волосков в одной из тычинок. Результаты заносят в табл. 20.1. После чего приступают к анализу следующего цветка.

Рис. 20.4. Тычинки, помещенные в вазелиновое масло на предметное
стекло

Частота соматических мутаций и потеря репродуктивной способности клеток могут быть рассчитаны либо по дням для каждого варианта опыта, либо для каждого растения за весь период наблюдений. При этом используют следующие формулы для расчетов:

где А — частота соматических мутаций; В — число всех зарегистрированных для данного опыта розовых мутантных секторов; С — сумма проанализированных волосков тычинок.
Таблица 20.1
Данные оценки мутагенного и токсического действия образцов природных вод (по Т. И. Евсеевой, 2001)

Код препарата	Порядковый номер цветка	Количество волосков на тычинку	Количество волосков в цветке	Розовые мутантные события	Количество волосков, остановившихся в росте
Контроль 1	1	42	42 • 6 = 252	1	2
Контроль2	1	44	264	0	0
Проба 1/1	1	50	300	0	1
Проба 1/1	2	53	318	2	3

Таблица 20.2

Частота соматических мутаций и потеря репродуктивной способности клеток волосков тычинок традесканции (клон 02) при действии Th
(по Т. И. Евсеевой, 2001)

Концентрация 232Th, мг/л	Количество просмот ренных волосков тычинок, шт.	Соматические мутации, %		Потеря репродуктивной способности клеток, %
Концентрация 232Th, мг/л	Количество просмот ренных волосков тычинок, шт.	X±Sy	инкре мент	X±Sy	инкре мент
0,088	12657	0,198 ±0,045	0,081	0,055 ±0,045	-0,017
0,177 П	20506	0,117* ±0,004	0,061	0,102 ± 0,028	0,047
0,360	13424	0,238** ±0,030	0,170	0,342 ± 0,040	0,290

Примечание, х - среднее значение; Ь - стандатная ошибка; * - отличие от контроля достоверно при р lt; 0,05; ** - отличие от контроля достоверно при
р lt; 0,001.

Рис. 20.5. Динамика частот соматических мутаций (столбцы серого цвета) и потери репродуктивной способности клеток (белые столбцы) волосков тычинок традесканции (клон 02) в контроле (дистиллированная вода; температура 24 °С; освещенность 25 тыс. лк).
По оси абсцисс — дни цветения растений; по оси ординат — частоты нарушений в волосках тычинок традесканции, %

где D — потеря репродуктивной способности клеток; Е — число всех зарегистрированных укороченных волосков для данного опыта; С — сумма проанализированных волосков тычинок.
Пример. Рассчитаем по табл. 20.1 частоты нарушений по дням: частота соматических мутаций в контроле (повторность 1) А = 100 • 1/252 (%); потеря репродуктивной способности клеток
(для пробы 1) D= (1 + 3) 100/(300 + 318) (%).
По общепринятой методике Г. Крамера проводят расчет средних значений и стандартных отклонений частот нарушений в волосках тычинок. Статистическая обработка данных может включать также анализ распределений и проверку выборок на наличие выбросов. Оценивают достоверность отличия частот повреждений, регистрируемых в опытных образцах и контроле. Полученные результаты представить в виде таблиц и диаграмм (см. табл. 20.2 и рис. 20.5).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Евсеева Т. И. Сочетанное действие факторов радиационной и нерадиационной природы на традесканцию / Т. И. Евсеева, С.А.Герасысин. — Екатеринбург: УрО РАН, 2001.
Крамер Г. Математические методы статистики. — М.: Мир, 1975.
Сперроу А. X. Возникновение соматических мутаций в Tradescantia под действием химических мутагенов ЭМС (этилметансульфонат) и ДБЭ (1,2- дибромэтан) и специфических загрязнителей атмосферы Оэ, S02, N02 / А. X. Сперроу [и др.] // Генетические последствия загрязнения окружающей среды. — М.: Наука, 1977.
Ма Т. Н. Tradescantia cytogenetic tests (root timitosis, pollen mitosis, pollen mother meiosis). A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- Tox Program // Mutat. Res., 1982. — Vol. 99.

<< | >>

Источник: О. П. Мелехова, Е. И. Егорова, Т. И. Евсеева. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование : учеб, пособие для сгуд. высш. учеб, заведений. 2007

Еще по теме Лабораторная работа №20. ИСПОЛЬЗОВАНИЕТРАДЕСКАНЦИИ (КЛОН 02) ДЛЯ ОЦЕНКИ МУТАГЕННОГОИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ (Лабораторная работа подготовлена Т. И. Евсеевой и С. А. Гераськиным):

- Геоэкология - Основы экологии - Экологический мониторинг - Экология животных - Экология насекомых - Экология почв и агроэкология - Экология птиц - Экология рыб -

- Биология/a> - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -