ВЛИЯНИЕ АЭРАЦИИ И ТЕМПЕРАТУРЫ НА СТРУКТУРУИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ МИКРОБНЫХ КОМПЛЕКСОВВЕРХОВОГО ТОРФЯНИКА (МОДЕЛЬНЫЕ ОПЫТЫ) А.              В. Головченко, Т. Г. Добровольская, О. С. Кухаренко, Т. А. Семёнова, О. Ю. Богданова, Д. Г. Звягинцев

'Московский государственный университет, г. Москва, dobrtata@mail.ru

"Институт проблем эволюции и экологии РАН, г. Москва, tashino@mail.ru

В годичном модельном опыте осуществляли мониторинг за численностью и таксономической структурой микробных комплексов монолитов верхового торфяника, хранящихся при комнатной температуре и в холодильнике (4-6 0С), а также в перемешиваемых слоях торфа.

Низкая скорость деструкции растительных остатков в верховых торфяниках, приводящая к накоплению торфа, заставляет задуматься о том, какие факторы лимитируют функционирование микроорганизмов в этом земноводном биотопе. Из факторов, ингибирующих микробную активность в верховых торфяниках, упоминаются: анаэробиоз, повышенная кислотность, низкая температура, недостаток элементов минерального питания, токсичность фенольных соединений и др. [1, 2, 3, 4, 5]. Несмотря на множество исследований, проведенных болотоведами, микробиологами, почвоведами, проблема замедленной деструкции торфа в олиготрофных торфяниках до сих пор остается во многом нерешенной.

В настоящей работе мы оценивали влияние усиления аэрации (путем перемешивания торфа) и понижения температуры (с 20-24 0С до 4-6 0С) на разнообразие и функционирование микробных сообществ в различных слоях верхового торфяника в модельном эксперименте.

Объект исследования - верховой торфяник под сосняком андромедово-пушицево- сфагновым, расположенный на территории Западнодвинского лесоболотного стационара Института лесоведения РАН.

В течение года (анализировались 0, 7, 14, 30, 60, 90, 120. 150, 180, 270 и 365-е сутки) отбирались пробы для проведения микробиологического анализа. Определение численности бактерий, длины грибного и актиномицетного мицелия проводились люминесцентномикроскопическим методом [6]. Для количественного учета клеток бактерий и мицелия актиномицетов препараты окрашивали водным раствором акридина оранжевого, а для окраски мицелия и спор грибов применяли калькофлуор белый. Таксономический состав бактерий и актиномицетов определяли методом посева на глюкозо-пептонно- дрожжевую и среду Гаузе с последующим определением культур-доминантов на основании фенотипических признаков по определителям Берджи и Гаузе. Таксономический состав микромицетов изучали методом посева на подкисленную агаризованную среду Чапека. Видовую идентификацию проводили по общепринятым определителям и интернет-ресурсам (indexfungorum.org и др.). Эмиссию CO2 определяли на газовом хроматографе с калибровкой по газовой смеси с известной концентрацией CO2..

Результаты исследований

Влияние аэрации на структуру микробных сообществ, осуществляющих процесс деструкции торфа

Показателем интенсивности деструкции торфа является степень его разложения, которая при усилении аэрации в результате постоянного перемешивания слоёв, спустя год после начала эксперимента увеличилась в 4 раза в слое Т1 (от 10 до 40 %), в 3 раза - в слое Т2 (от 5 до 17 %) и осталась на том же уровне, что и в начале опыта (5 %) в очесе сфагнового мха (Т0).

В результате определения водно-физических свойств слоёв торфяника Т1 и Т2 было установлено, что постоянное их перемешивание привело к значительному улучшению водно-воздушного режима, что проявилось в уменьшении объема пор, занятых водой и в увеличении объема пор, занятых воздухом. Так, в слое Т1 монолита объем пор, занятых водой, составил 30 %, а в слое Т2 - 45 %, при перемешивании этих слоёв он уменьшился до 9 %. В то же время объем пор, занятых воздухом, увеличивался при нарушении структуры торфяника от 48 до 77 % в горизонте Т1, и от 29 до 79 % - в горизонте Т2.

Улучшение водно-воздушного режима сопровождалось ростом интенсивности дыхания микробного сообщества. Так, уже через месяц после начала эксперимента, эмиссия CO2 в перемешиваемых образцах Т0 и Т1 превысила в 1,5-2 раза величину потока диоксида углерода из монолитных образцов торфа. Выявленная тенденция сохранялась до конца опыта. В слое Т2 на протяжении первых трёх месяцев перемешиваемые образцы и образцы монолита достоверно не различались, однако к концу эксперимента различия между вариантами по эмиссии CO2 были такими же как и в верхних слоях торфяника.

В перемешиваемых образцах, в отличие от образцов монолита, наблюдали снижение показателя C/N в составе органического вещества с 58 до 36. Вероятно, это связано с ростом микроорганизмов и накоплением азота микробной биомассы в окислительных условиях.

Теперь проанализируем - какие группы микроорганизмов осуществляли деструкцию торфа в условиях повышенной аэрации.

Длина грибного мицелия, выявленная в процессе мониторинга, в перемешиваемых образцах варьировала от 4 до 36 км/г, в образцах монолита - от 0,3 до 13 км/г. Перемешивание способствовало увеличению длины грибного мицелия. Практически на всех этапах опыта его длина в образцах с нарушенной структурой была в среднем в 6, а максимально в 10 раз выше, чем в образцах монолита. Для грибных спор (в отличие от мицелия) была выявлена обратная тенденция - уменьшение их численности при перемешивании.

В микробной биомассе во всех вариантах опыта и на всех стадиях сукцессии доминировала грибная составляющая микробной биомассы (60-99 %), которая и определяла её динамику на протяжении всего опыта. Её запасы варьировали в ходе годовой сукцессии в образцах монолита - от 2 до 48 мг/г, в образцах с нарушенной структурой - от 3 до 124 мг/г. При перемешивании торфа грибная биомасса возрастала. Она была в среднем - в 4 раза, а максимально - в 7 раз выше в аэрируемых образцах, чем в образцах монолита.

В морфологической структуре грибного комплекса исследуемых образцов доминировал мицелий (60-99 %), и только в слое Т2 на последних стадиях сукцессии преобладали споры (60-74 %). Перемешивание слоев торфа способствовало увеличению доли мицелия и сведению к минимуму доли спор в грибном комплексе.

В исследуемых вариантах опыта нам удалось проследить динамику относительного обилия базидиомицетовых грибов - энергичных деструкторов лигнино-целлюлозного комплекса. Их доля в грибном комплексе в нулевой точке опыта составила 10-25 %, на всех последующих этапах она возрастала до 40-100 %. В результате перемешивания слоёв торфа происходило увеличение относительного обилия этой группы грибов, так на некоторых этапах сукцессии её доля в образцах с нарушенной структурой была в среднем на 20-25 %, а максимально - на 45 % выше, чем в образцах монолита. Среди базидиомицетовых грибов важная роль в деструкции сфагновых клеток отводится паразитическому грибу Lyophyllum palustre, который проникает в живую клетку мха и растворяет её клеточную стенку [7].

Перемешивание слоёв исследуемого торфяника приводило к снижению видового разнообразия микромицетного комплекса за счет исчезновения редких и случайных видов и повышения частоты встречаемости и относительного обилия доминирующих и часто встречающихся видов микромицетов. Доминирующими были представители родов Penicillium, Oidiodendron, Trichosporiella.

Перемешивание не оказало стимулирующего эффекта на показатели обилия прокариотных микроорганизмов. В хорошо аэрируемых образцах численность бактерий на одних этапах сукцессии была сравнима с таковой в образцах монолита, на других - была даже в 2-3 раза меньше. Не было выявлено четких закономерностей по влиянию перемешивания на плотность актиномицетного мицелия.

Нарушение структуры торфяника, осуществляемое путем постоянного перемешивания его слоёв, внесло коррективы в соотношение групп внутри сапротрофного бактериального комплекса в сторону увеличения доли бактерий-гидролитиков. Так, для верхнего слоя монолита (Т0) на всех этапах сукцессии было характерно доминирование протеобактерий, представленных большей частью родами Aquaspirillum и Comamonas. Перемешивание этого слоя стимулировало развитие актинобактерий, которые стали монодоминантами через год после начала опыта. В слоях монолита Т1 и Т2 на всех этапах сукцессии доминировали протеобактерии и бациллы, составляя примерно равные доли. Перемешивание этих слоёв привело к монодоминированию на разных этапах сукцессии бацилл и актиномицетов. Численность бацилл в разных слоях торфяника составила в среднем 2-12 млн. КОЕ/г. Предварительный прогрев торфяной суспензии перед посевом при температуре 80 0С в течение 10 минут позволил придти к заключению, что большая часть бацилл в исследуемом торфянике находится в виде вегетативных клеток, т.е. в активном состоянии. В перемешиваемых образцах их доля увеличивалась до 80-90 %. В результате посева образцов из слоёв Т1 и Т2 на среды с крахмалом, пектином, карбокси- метилцеллюлозой (КМЦ) и хитином было показано, что бациллы разных видов на всех перечисленных средах способны осуществлять гидролитические функции.

Влияние температуры на численность и функционирование микробных сообществ,

осуществляющих процесс деструкции торфа

Длина грибного мицелия в верхних слоях монолита (Т0 и Т1) варьировала от 3 до 21 км/г в зависимости от температурного режима и стадии сукцессии. В Т0 значения этого показателя были выше (почти в 2 раза) при низкой температуре, чем при температуре 20-24 0С практически на всех этапах сукцессии. В слое Т1 была выявлена обратная тенденция - длина мицелия была в 1,5 раза выше при комнатной температуре, чем при температуре холодильника. В слое Т2 длина мицелия была на порядок ниже, чем в слоях Т0 и Т1. В этом слое на одних этапах сукцессии плотность мицелия была выше при комнатной температуре, на других - при температуре 4-6 0С. Численность грибных спор варьировала, в зависимости от варианта опыта и стадии сукцессии, от 50 до 200 млн. спор/г. Количество грибных спор было примерно одинаковым при разных температурных режимах.

В процессе годового мониторинга в монолитах, хранящихся при разных температурах, менялось соотношение групп грибов. Так, при низкой температуре во всех слоях возрастало относительное обилие темноокрашенного мицелия, а в очёсе сфагнового мха и в слое Т2 увеличивалась не только доля, но и средние значения его длины. Они были выше в 3 раза в Т0 и в 1,5-2 раза - в Т2 при низкой температуре, чем при температуре 20-24 0С.

Кроме того, нами было показано, что базидиомицетовые грибы, являющиеся энергичными деструкторами лигнино-целлюлозного комплекса, способны существовать при низкой температуре длительное время, при этом увеличивались не только относительные, но и абсолютные показатели их обилия. Особенно чётко эта тенденция была выявлена в слоях Т0 и Т1. В очёсе средние значения длины пряжкового мицелия были в 2 раза выше при температуре 4-6 0С и составили 10,2 км/г. Доля этой группы грибов через месяц после начала опыта увеличилась в слое Т0 с 10 до 80, а в слое Т1 - от 20 до 80-100 % .

Биомасса почвенных грибов была максимальной в слое Т0 и варьировала в зависимости от температурного режима и этапа сукцессии от 10 до 70 мг/г. В этом слое на всех этапах сукцессии она была выше при низкой температуре. Увеличение пула грибов в Т0 происходило быстрее при низкой температуре - уже через месяц фиксировали пятикратное превышение биомассы, тогда как при комнатной температуре наблюдали существенный прирост биомассы (в 3 раза) только к концу второго месяца. В слоях Т1 и Т2 чёткой корреляции между грибной биомассой и температурой не выявлено - на одних этапах она была выше при комнатной температуре, на других - при температуре холодильника. Температурный режим не влиял на морфологическую структуру грибного комплекса. В обоих вариантах опыта в ней доминировал его активный компонент - мицелий. Его доля составляла 88-99 %. Иную морфологическую структуру грибного комплекса наблюдали только в слое Т2 - на последних стадиях годовой сукцессии - в обоих вариантах опыта в ней преобладали споры.

При смене температурного режима с 20-24 0С на 4-6 0С не происходило существенной корректировки видового разнообразия микромицетов, варьировала лишь доля и частота встречаемости отдельных видов. Так, одни виды чаще выделялись при пониженной температуре (Oidiodendron griseum, Trichosporiella cerebriformis, некоторые виды рода Penicillium и стерильный мицелий), частота встречаемости других видов была выше при комнатной температуре (Aspergillus versicolor (Vuill.) Tiraboschi, Verticillium sp., Mucor circinelloides Tiegh.). Большинство выделенных микромицетов относятся к группе медленнорастущих целлюлозолитиков. Быстрорастущие микромицеты-сахаролитики (в первую очередь, мукоровые грибы), основу питания которых составляет легкодоступная органика, встречались единично.

Низкие температуры повлияли на показатели обилия бактерий, полученные прямым методом. При снижении температуры численность и биомасса бактерий уменьшалась в 2-4 раза практически на всех этапах сукцессии. Не удалось выявить чёткой корреляции между температурным режимом и актиномицетным мицелием из-за мозаичности его распределения по профилю. Однако, на некоторых этапах сукцессии в слоях Т0 и Т1 его длина была в 2-6 раз выше при комнатной температуре, чем при температуре холодильника.

Разные слои торфяника четко отличались по таксономической структуре исследуемого бактериального комплекса, и её динамике в процессе годового мониторинга. В верхнем слое Т0 на всех этапах сукцессии доминировали протеобактерии. Вторым доминантом в бактериальном комплексе исходно были актинобактерии. При снижении температуры их доля резко уменьшалась, и они переходили в разряд минорных компонентов. В слоях Т1 и Т2 таксономическая структура бактериального блока была иная, чем в Т0. На всех этапах сукцессии при комнатной температуре доминировали протеобактерии и бациллы, составляя примерно равные доли. Актинобактерии были минорными компонентами, либо вообще не выделялись. Низкая температура привела к доминированию в этих слоях спорообразующих бактерий почти на всех этапах сукцессии.

Заключение

Проведенные нами модельные опыты показали, что для грибов, доминирующих в микробной биомассе верховых торфяников, основным фактором, ограничивающим их функционирование, является недостаток кислорода. Перемешивание слоёв верхового торфяника приводит к улучшению водно-воздушного режима и устраняет для грибов с одной стороны анаэробную ловушку, с другой стороны - разобщенность субстрата, ферментов и микробных клеток, тем самым создавая благоприятные условия для их развития. В хорошо аэрируемых образцах увеличивались показатели обилия грибов и возрастала доля базидиомицетов - энергичных деструкторов лигнино-целлюлозного комплекса.

Что касается бактерий, то аэрация не является, по-видимому, тем значимым фактором, который может тормозить их размножение и функционирование. Об этом свидетельствуют не только данные по их сходной численности в монолите и перемешиваемых образцах, но и выявляемое в торфяниках большое разнообразие аэробных бактерий. Благодаря малым размерам, они способны размножаться в микролокусах, различающихся по доступности кислорода. Следует отметить, что при перемешивании возрастала доля бактерий гидролитического комплекса. Однако их спектр в верховых торфяниках менее представителен, чем в низинных торфяниках. В нем практически отсутствуют целлюлозоразрушающие миксобактерии и цитофаги. Возможно, что одним из факторов, ограничивающих развитие этих бактерий в верховых болотах, является токсичность «сфагнолов».

Анализ воздействия температуры, при которой выдерживались монолиты торфяника, позволил сделать заключение об адаптации грибов и бактерий гидролитического комплекса, обитающих в торфяниках, к низким температурам, которые характерны для этих местообитаний.

Литература Бамбалов Н.Н. Анализ биологических факторов разложения органического вещества в болотной среде // Сборник материалов 5 научной школы (11-14 сентября 2006). - Томск: ЦНТИ, 2006. - С. 18-27. Заварзин Г. А. Лекции по природоведческой микробиологии. - М.: Наука, 2003. - С. 234-243. Aerts R., Verhoeven J. T. A., Whigham D.F. Plant-mediated controls on nutrient cycling in temperate fens and bogs // Ecology. - 1999. - V. 80. - № 7. - P. 2170-2181. Freeman C., Ostle N.J., Fenner N., Kang H. A regulatory role for phenol oxidase during decomposition in peatlands // Soil Biol.Biochem. - 2004. - V. 36. - P. 1663-1667. Moore O. The ecology of peat-forming processes: a review // Int. J. of Coal Geology. - 1989. - V. 12. - P. 89-103. Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. Д.Г. Звягинцева. - М., 1991. - 303 с. Untiedt E., Mueller K. Colonization of Sphagnum cells by Lyophyllum palustre // Can. J. Bot. 63.

1985. - P. 757-761.

INFLUENCE OF AERATION AND TEMPERATURE ON THE STRUCTURE AND

FUNCTIONING OF MICROBIAL COMPLEXES IN THE BOG (MODEL EXPERIMENT) V. Golovchenko, T. G. Dobrovol’skaya, O. S. Kukharenko, T. A. Semenova,

O.              Ju. Bogdanova, D. G. Zvyagintsev

A year long model experiment was established to observe changes in number and structure of microbial complexes in high-moor peat’s monoliths, which were stored under room temperature (20-24 0С) and in the fridge (4-6 0С), and in mixed peat layers. It was ascertained, that increase in aeration activated the functioning of soil fungi, which led to the intensification of СО2 emission and peat decomposition. The increase in aeration did not stimulate the increase in number of bacteria unlike mycelial microorganisms. The most of fungi and bacteria grew well under low temperature, herewith the share of basidiomycetes as well as bacilli, which were active destructors of plant remnants, rose.

УДК 252.62