Определение активности супероксиддисмутазы

феназинметасульфата по методике [85] в нашей модификации. Для этого растительную навеску (1,5-2 г) растирали с экстрагирующей средой, содержащей 150 мМ №,К-фосфатный буфер рН 7,8, 1 мМ EDTA и 1% ПВП, фильтровали и центрифугировали (15 мин, 8000 об/мин).

4.2.7.1. Выделение каталазы, общей пероксидазы, аскорбатпероксидазы Для выделения каталазы, а также общей пероксидазы и аскорбатпероксидазы использовали экстрагирующую среду, которая содержала: 50 мМ К-фосфатный буфер (рН 7,5), 1 мМ ЭДТА, 0,3% Тритон Х-100, 1 мМ аскорбиновую кислоту [156]. После фильтрования и центрифугирования (15 мин, 8000 об/мин) в полученном супернатанте определяли активность данных ферментов.

4.2.7.2. Исследование активности каталазы Реакционная среда для определения активности каталазы содержала: 100 мМ К-фосфатного буфера (рН 7,0), 15 мМ Н₂О₂ и 0,1 мл пробы. Реакцию начинали добавлением Н₂О₂. Изменение оптической плотности проводили при 240 нм и рассчитывали активность фермента с использованием коэффициент экстинкции £ = 0.036 (мМ см)^-1 и выражали в единицах акт/мг белка.

4.2.1А. Определение активности общей пероксидазы Активность общей пероксидазы определяли с использованием о- дианизидина по методике. Реакционная среда содержала: 50 мМ Na-ацетатный буфер (рН 5,2), 0,5 мМ о-дианизидина, 2 мМ Н₂О₂ и 0,1 мл пробы. Изменение оптической плотности проводили при 460 нм и рассчитывали активность с использованием коэффициента экстинкции s = 11,3 (мМ см)^-1.

4.2.7.5. Определение активности аскорбатпероксидазы

Активность аскорбатпероксидазы определяли в среде следующего состава: 50 мМ К-фосфатный буфер рН 7,0, 0,5 мМ аскорбат, 0,2 мМ Н₂О₂. Реакцию начинали добавлением 0,1 мл пробы. Изменение оптической плотности определяли при 290 нм. Активность фермента рассчитывали, используя коэффициент экстинкции s = 2,8 (мМ см)^-1 и выражали на мг белка.

4.2.2. Выделение клеточных фракций

Клеточные фракции получали методом дифференциального центрифугирования [20] в нашей модификации. Растительную навеску гомогенизировали с пятикратным объемом 0,4 М раствора сахарозы в трис- HCl буфере, рН 7,8, содержащим 2 мМ раствор ЭТДА и 0,1% альбумин. Гомогенат фильтровали и центрифугировали при 1000 об/мин 10 мин. Далее супернатант центрифугировали при 8000 об/мин 7 мин. Полученный обогащенный хлоропластами осадок разрушали с помощью осмотического шока, инкубируя его в течение 3-5 мин в буфере. Для получения митохондриальной фракции надосадочную жидкость снова центрифугируется при более высокой скорости - 14500 об/мин в течение 15 минут. Образовавшийся осадок митохондрий промывался буфером с сахарозой и повторно центрифугировался при 14500 об/мин.