4.2.1. Определение активности маркерного фермента сукцинатдегидрогеназы

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) является маркерным ферментом, используемым для определения чистоты фракций митохондрий. Метод основан на восстановлении дихлорфенолиндофенол в присутствии ФМС при

ферментативном окислении сукцината [152].

56. Для расчета активности использовали коэффициент экстинкции 20 мМ ^-1 ■ см^-1 и рассчитывали на мг белка.

4.2.10. Определение содержания хлорофилла в клеточных фракциях Для определения чистоты выделенных фракций хлоропластов исследовали содержание хлорофилла, используя методику [30]. Хлорофилл извлекали из клеточной фракции с помощью 96% этанола и определяли оптическую плотность на СФ-56 при 652 нм. Содержание пигментов рассчитывали по формуле:

^С(а+в) = ^25,1 ' ^D652

4.2.11. Электрофоретическое определение присутствия липоксигеназы в

клеточных компартментах

Электрофоретическое определение липоксигеназы проводили методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по Дэвису [32]. Для концентрирования белковых растворов применяли крупнопористый 2,0 % ПААГ; для разделения - мелкопористый - 7,5 % гель. Для выявления зон локализации молекулярных форм липоксигеназ использовали метод Хейдека [178]. Данный метод основан на образовании йод-крахмального комплекса в присутствии йодистого калия и гидроперекисей линолевой кислоты. С этой целью перед началом полимеризации в нижний ПААГ вносили растворимый крахмал («Медлекс», Россия) до конечной концентрации 1%. В ячейки геля вносили анализируемые фракции митохондрий, хлоропластов и цитоплазмы в объеме 50 мкл (не более 200 мкг белка). В качестве маркера электрофоретического фронта использовали краситель бромфеноловый синий.

После окончания электрофореза пластинки геля разрезались на части. На одной находились маркерные ферменты, которые проявлялись с помощью кумасси R-250. Оставшуюся часть электрофоретической пластинки для определения присутствия липоксигеназы помещали на 30 мин в раствор, содержащий 0,5% линолевую кислоту в 0,1 М трис-НС1-буфере, рН 6,8. Линолевую кислоту предварительно растворяли в буфере в течение 40 минут. Затем оставшуюся часть пластинки геля тщательно отмывали дистиллированной водой и помещали в проявляющую смесь, состоящую из 100 мл 7% уксусной кислоты и 5 мл свежеприготовленного 0,1 М раствора йодистого калия. Специфическая окраска гелей проявляется через 15-20 мин в виде коричневых пятен на желтом фоне. Окраска пластинок геля является нестабильной, поэтому результаты электрофоретического разделения сразу переводились в цифровой формат.

4.2.12. Определение количества белка Содержание белка во всех пробах определяли с помощью метода Lowry [232] при длине волны 750 нм. Метод основан на образовании комплексного окрашенного соединения, сочетает в себе биуретовую реакцию и реакцию Фолина (на тирозин и триптофан).

4.2.13. Статистическая обработка результатов Все определения проводили в двух биологических и двух аналитических повторностях. В таблицах и на графиках представлены данные одного из типичных опытов в виде средних арифметических значение и их стандартных отклонений.