ОЦЕНКА, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ЗАРОДЫШЕЙ

Специальные исследования свидетельствуют, что частота отклонений от нормы у яйцеклеток, выделившихся во время суперовуляции, более высокая, чем при овуляции у животных без гормональных обработок.

Морфологическую оценку зародышей проводят с использованием инвертированного микроскопа МБИ-13. При этом учитывают соответствие стадии развития зародыша его возрасту, целостность и форму прозрачной оболочки, равномерность дробления бластомеров и состояние их цитоплазмы, величину и прозрачность перивителлинового пространства. Зародыши с признаками дегенерации, уродств и недоразвития для пересадок непригодны. (Подробно методика изложена в «Практикуме по аку шерству, гинекологии и искусственному осеменению сельскохозяйственных животных».)

После морфологической оценки зародышей до пересадки можно кратковременно хранить в термостате при температуре 37 °С. При этом их помещают на часовое стекло в 0,5 мл среды Дюль- бекко с добавлением 20 % фетальной сыворотки теленка или сыворотки овцы. Часовые стекла с зародышами ставят в чашки Петри, на дно которых кладут увлажненную фильтровальную бумагу. Таким образом сохраняется жизнеспособность зародышей и обеспечивается возможность более точного выявления их полноценности.

Для замораживания зародышей готовят среду из следующих компонентов (в г/л): натрия хлорид 8,0; калия хлорид 0,2; гидроортофосфат (динат- рийфосфат) безводный 1,15; дигидро- ортофосфат (монокалийфосфат) одно- замещенный 0,2; магния хлорид, содержащий 6 молекул воды, 0,1; калия хлорид безводный 0,1; натрия пируват 0,076; глюкоза 1,0.

мл среды добавляют 1000 ЕД пенициллина и 2 мл фетальной сыворотки). Затем готовят серию растворов с разной концентрацией глицерина по методике, изложенной в инструкции, и насыщают зародыш глицерином одно- или многоступенчатым способом. Этот процесс контролируют под микроскопом в стерильных условиях при температуре 20 °С, после чего зародыши сразу замораживают в стеклянных пробирках или ампулах, пластиковых соломинках, которые маркируют.

Охлаждение проводят в несколько этапов: 1) снижают температуру от 20 °С до минус 5—7 °С со скоростью 1—10 °Св 1

мин; 2) при минус 6—7 °С проводят искусственную кристаллизацию, касаясь пинцетом, переохлажденным в жидком азоте, поверхности контейнера с зародышами; 3) продолжают охлаждать со скоростью 0,3 °С в 1 мин до минус 36 °С; 4) погружают в жидкий азот для быстрого охлаждения до минус 196 °С. Хранят замороженные эмбрионы в сосудах Дьюара. Для оттаивания емкости с зародышами быстро переносят в водяную баню с температурой 25—37 °С и держат до исчезновения льда.

Вместе с раствором криопротектора эмбрион помещают на часовое стекло, предварительно оценивают под лупой и удаляют криопротектор, помещая зародыш в заранее приготовленные растворы глицерина убывающей концентрации. Затем еще раз оценивают качество зародышей под микроскопом. Когда эмбрионов замораживают в соломинках с раствором глицерина и сахарозы, то после оттаивания соломинку несколько раз встряхивают (подобно термометру). При этом пробка, закрывающая соломинку, должна быть направлена вверх. Для уравновешивания осмотического давления и удаления криопротектора из зародыша соломинку помещают вертикально (пыжом вверх) в водяную баню с температурой 25—37 °С. Затем приступают к пересадке эмбриона (Н. И. Сергеев, С. А. Мазепкин).

Разработаны и другие способы культивирования зародышей вне организма, позволяющие сохранять их жизнеспособность до 24—48 ч. Зародышей можно культивировать в пробирках, а также в ампулах и пайетах из поливинилхлорида. До 4—7 дней сохранить их можно в перевязанном яйцепроводе кролика. Однако наиболее перспективным методом является глубокое замораживание зародышей в жидком азоте при температуре минус 196 °С. Зародыши крупного рогатого скота лучше других переносят замораживание и размораживание; выживаемость — 50—70 %.