Трансгеноз белка оболочки вирусов

Одним из первых вирусных генов, перенесенных в растения табака, был ген структурного белка оболочки (СБО) ВТМ. С помощью гетерологичных промотеров была осуществлена экспрессия этого гена в клетках растений табака.

В этих экспериментах трансгенные растения табака, с высоким уровнем экспрессии СБО ВТМ, оказались более устойчивы к заражению суспензией ВТМ, чем к инокуляции препаратами РНК-ВТМ. Было высказано предположение о том, что одним из возможных механизмов устойчивости в данном случае может быть блокирование процесса диссоциации белка оболочки вирионов ВТМ, который необходим для высвобождения вирусной РНК и запуска начальных этапов инфекционного процесса. Успешное заражение трансгенных растений препаратами РНК ВТМ объясняется, помимо отсутствия в данном случае, стадии диссоциации, еще и тем, что межклеточный транспорт вирусной РНК, в этой системе, не нуждается в наличии белка оболочки.
Блокирование первичных стадий инфекционного процесса подтверждено в экспериментах по заражению протопластов различных типов клеток табака. Экспрессия СБО-гена ВТМ в протопластах эпидермальных клеток приводит к возникновению устойчивости этих протопластов к заражению ВТМ. Использование же промотеров, специфически направляющих экспрессию гена СБО в мезофильных клетках, не приводит к устойчивости протопластов этих клеток к заражению ВТМ.
Прямое доказательство гипотезы о механизме СБО-индуцированной устойчивости трансгенных растений к ВТМ получено в экспериментах с м-РНК Р-глюкуронидазы (GUS), которую инкапсулировали в белок оболочки ВТМ. Такие ВТМ-подобные частицы (псевдовирионы) были использованы для инокуляции протопластов трансгенных и нетрансгенных Табаков. Уровень экспрессии GUS м-РНК в протопластах трансгенных линий табака, несущих СБО-ген ВТМ, был значительно ниже экспрессии в протопластах нетрансгенных растений. Это однозначно можно объяснить только блокированием процесса отделения СБО от GUS м-РНК в клетках, синтезирующих большое количество структурного белка оболочки ВТМ.
Дальнейшие исследования механизмов устойчивости растений к вирусам, обусловленной экспрессией генов СБО в трансгенах [СБО(+) растения], показали наличие в данном случае многоуровневой эшелонированной защиты. При инокуляции растений препаратами вирусов, вызывающих пят
нистости на листьях, во всех случаях наблюдается снижение среднего 477 удельного количества инфекционных пятен на один лист у СБО(+)-трансге- нов по сравнению с СБО(-)-линиями того же сорта. Из этого следует, что одним из возможных сайтов реализации противовирусной защиты может быть барьер создаваемый на первых ступенях развития инфекционного процесса. Таким образом экспрессия генов СБО в клетках трансгенных растений, по-видимому, приводит к взаимодействию СБО со структурами растительной ткани, ответственными за устойчивость к проникновению вирусной инфекции.
Сравнительное изучение последующих стадий развития инфекционного процесса в СБО(+)- и СБО(-)-растениях табака проводилось следующим образом. Были подобраны концентрации ВТМ в инокулюмах таким образом, чтобы они давали примерно одинаковое удельное число некрозов на лист СБО(+) и СБО(-) растений. Анализ среднего количества вируса в каждом инфекционном пятне показал, что существенной разницы по этому показателю между СБО(+) и СБО(-) линиями нет. Иммунологический анализ сегментов листьев, вырезанных из областей между инфекционными пятнами, однако, выявил, что в случае СБО(+)-растений накопление вируса в этих частях листьев достоверно меньше, чем в случае СБО(-)-растений. Это позволяет сделать вывод о том, что экспрессия генов ВТМ, кодирующих СБО, в растениях табака индуцирует возникновение второго защитного барьера на уровне распространения вирусов в листовой ткани.
Для проверки влияния СБО на транспорт ВТМ по сосудистой системе был проведен прививочный эксперимент. Фрагмент трансгенного растения с СБО был привит на ВТМ-восприимчивое нетрансгенное растение. Оказалось, что транспорт ВТМ через привитый сегмент подавляется.
Это подтверждает предположение о блокировании механизмов распространения вируса по сосудистой системе трансгенных растений, экспрессирующих ген СБО.

Возможно, однако, что передвижение ВТМ по сосудам сопровождается чередующимися процессами ассимиляции и диссимиляции вирионов. В этом случае блокирование транспорта вируса по сосудистой системе может быть вторичным следствием ингибирования диссимиляции вирионов.
Дополнительные доказательства, подтверждающие гипотезу о блокирующем действии генов вирусных СБО на стадии диссимиляции вирионов, основаны на результатах экспериментов с вирусом мозаики люцерны (ВМЛ). Однако в этом случае механизмы устойчивости более сложны, чем в случае с устойчивостью против ВТМ. У линий, имеющих низкий уровень экспрессии генов ВМЛ, кодирующих СБО, устойчивость наблюдалась только при заражении ВМЛ-вирионами. В противоположность этому, у трансгенных линий, экспрессирующих мутантный СБО или большие количества СБО дикого типа, устойчивость против ВМЛ имела место при заражении и препаратами РНК, и вирионами. Как и в случае с ВТМ, зависимость устойчивости от типа инокулюма позволяет предположить, что устойчивость против

478 ВМЛ действует, по крайней мере, на двух уровнях. На одном уровне может иметь место ингибирование диссимиляции вирионов при низком уровне экспрессии СБО. Второй уровень устойчивости, который проявляется у линий с мутантным СБО или с высоким уровнем экспрессии гена СБО дикого типа, может включать в себя любые взаимодействия СБО, необходимые для инфекционного цикла вируса. Это могут быть взаимодействия с вирусной РНК, необходимые для сборки вирионов или репликации вируса, или взаимодействия СБО с рецепторами растения-хозяина.
Устойчивость против Х-вируса картофеля (ХВК) также оказалась эффективной при заражении и РНК-инокулюмом, и вирионным инокулюмом. Как и в случае устойчивости к ВМЛ, здесь может иметь место блокирование всех стадий инфекционного процесса, необходимых для репликации и транспорта ХВК в инфицированном растении. Есть основания предполагать, что взаимодействие синтезируемого трансгенным растением СБО с сайтом начала сборки ХВК может приводить к возникновению устойчивости. У потексвирусов начало сборки происходит на 5-конце вирусного генома, так что взаимодействие со СБО может блокировать трансляцию вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая кодируется на 5-конце открытой считывающей рамки. Возможно, однако, также, что устойчивость к ХВК обусловлена ингибированием межклеточного транспорта, для которого СБО оболочки является необходимым фактором.
Суммируя изложенные данные, можно сделать следующие выводы относительно механизмов защиты, реализующихся в трансгенных растениях, экспрессирующих ген белка оболочки вируса: В СБО(+)-растениях блокирование инфекции происходит на стадии, предшествующей синтезу минус цепи вирусной РНК (см. главу 2). Уровень защиты СБО(+)-растений табака значительно выше по отношению к ВТМ, чем к РНК ВТМ. Эта защита обусловлена синтезом белка оболочки ВТМ в клетках трансгенных растений и не связана с синтезом т-РНК — транскриптов СБО. Аналогичная ситуация имеет место и в случае с трансгенными растениями, несущими ген белка оболочки вируса мозаики люцерны. На уровень защиты СБО(+)-трансгенных растений влияет не только экспрессия гена белка оболочки, но и способность этого белка образовывать внутриклеточные вирусоподобные агрегаты. Прививка стеблей СБО(+) растений на проростки СБО(-) растений табака приводит к индукции устойчивости к системной инфекции ВТМ, при этом не предотвращается возможность развития первичных стадий инфекции.
Логично было бы предположить, что помимо вирусных структурных белков оболочки существуют и другие белки, экспрессия генов которых в растениях могла бы приводить к возникновению устойчивости к вирусным инфекциям. Рассмотрим свойства некоторых из таких белков, представляющих интерес как в теоретическом плане, поскольку могут быть использованы в качестве инструмента для изучения механизмов вирусо
устойчивости, так и в практическом плане, поскольку полученные транс- 479 гены сельскохозяйственных культур могут представлять конкретный практический интерес. 

Еще по теме Трансгеноз белка оболочки вирусов:

1. ПЛОД, ЕГО ОБОЛОЧКИ И ПЛАЦЕНТА
2. ПЛОД, ЕГО ОБОЛОЧКИ И ПЛАЦЕНТА
3. ВИРУСЫ И ФАГИ
4. Биосинтез белка
5. ВИРУСЫ И ФАГИ
6. Белка
7. ЭКОЛОГИЯ И НОЗОГЕОГРАФИЯ ВИРУСОВ
8. Белка
9. О ТЕРАТОГЕННОМ ДЕЙСТВИИ ВИРУСОВ
10. О СКОРОСТИ ОБНОВЛЕНИЯ БЕЛКА И ХЛОРОФИЛЛА В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ [24]
11. РАСТЕНИЯ-ИНДИКАТОРЫ В БОРЬБЕ С ВИРУСАМИ
12. Пептидная теория строения белка
13. ЧРЕЗВЫЧАЙНЫЕ СИТУАЦИИ С УЧАСТИЕМ ВИРУСОВ
14. АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ БЕЛКА В ЗДОРОВЫХ И ПОРАЖЕННЫХ ФИЛЛОКСЕРОЙ КОРНЯХ ВИНОГРАДА
15. ВОЗНИКНОВЕНИЕ И РАЗВИТИЕ УЧЕНИЯ О ВИРУСАХ БАКТЕРИЙ
16. АДЕНОВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ ПТИЦ, ВЫЗЫВАЕМАЯ ВИРУСАМИ CELO И GAL