Элиситоры грибов

Крупный геном мицелиальных грибов и трудности их генетической трансформации осложняют молекулярно-генетические манипуляции с их генами авирулентности. Поэтому у грибов клонировано гораздо меньше таких генов, чем у бактерий.

Первый исследованный avr-ген выделен из генома возбудителя оливковой плесени томата Cladosporium Julvum. Этот гриб заражает листья восприимчивых сортов томата через устьица, развивается в межклеточном пространстве, не формируя гаусторий и не заражая клеток, и питается клеточными эксудатами. В устойчивых сортах томата развитие гриба вызывает СВЧ-реакцию, причем взаимоотношения между сортами томата и расами гриба соответствует схеме «ген-на-ген». Голландский фитопатолог П. Де Вит в межклеточной жидкости томатов, зараженных расой А9 С. fulvum, обнаружил белок, отсутствующей как фильтрате гриба, растущего на искусственной питательной среде, так и в незараженных листьях томата. Инфильтрация межклетной жидкости, содержащей этот белок, в листья разных сортов томата вызывала СВЧ-реакцию только у сортов, несовместимых с расой А9 (имеющих ген устойчивости Cf9), т. е. этот белок обладал свойствами расоспецифического элиситора. Он состоит из 28 аминокислот, причем 6 из них — цистеин. После его секвенирования на основании генетического кода был синтезирован комплементарный полинуклеотид, использованный в качестве зонда для выделения из генома гриба гена авирулентности avr9 методом гибридизации ДНК. Первичный продукт гена avr9 содержит 63 аминокислоты и состоит из сигнального пептида, необ-

ходимого для транспорта через мембрану (23 аминокислоты), и внеклеточного белка из 40 аминокислот. Этот белок подвержен посттрансляционным модификациям: сначала грибная протеаза готовит интермедиат из 32-34 аминокислот, затем растительная (уже вне грибной гифы) готовит 28-ами- нокислотный пептид — элиситор. Он имеет боченкообразную структуру из трех антипараллельных линий, образующих P-структуру, и соединенных двумя петлями и тремя дисульфидными мостиками, которые связывают все 6 цистеинов в цистеиновый узелок. У животных белки, содержащие цистеиновые узелки, служат сигнальными молекулами. В Ауг9-белке такой узелок, возможно, повышает стабильность молекулы элиситора в апопла- сте листа и обеспечивает взаимодействие с R-белком.
Трансформация гена avr9 в расы, вирулентные для сортов томатов, имеющих ген Cf9, делает их авирулентными; разрывы последовательностей гена avr9, наоборот, восстанавливают вирулентность.
Ген avr? экспрессируется in vitro только в условиях низкой концентрации азота. Он не экспрессируется в конидиях и гифах, находящихся на поверхности листа. Значительная экспрессия происходит после внедрения гриба в устьица и очень сильная — в межклеточном пространстве, причем около сосудов больше, чем в мезофилле. Функции Ауг9-белка неизвестны, но его промотор имеет 12 сайтов, предположительно способных связываться с белком AREA Aspergillus nidulans — главный позитивный регуляторный ген, обеспечивающий репрессию/дерепрессию метаболизма азота. Гомолог AreA С. fulvim ген Nr/I экспрессируется в условиях азотного голодания и его белок NRF1 является регулятором активности Avr9. По-види- мому, Ауг9-белок участвует в поступлении азота в мицелий из субстрата или индуцирует освобождение и перераспределение азота в растении. Повышенная экспрессия avr9 в районе сосудов возможно связана с тем, что его продукт интерферирует с транспортом питательных веществ в растении.
Ген avr9 фланкирован (окружен по бокам) прямыми повторами, по которым может происходить рекомбинация, сопровождаемая вырезанием (дилетированием) гена (рис. 7.9, 2). Поэтому часто встречаются вирулентные расы, в геноме которых этот ген отсутствует.
Второй ген авирулентности, изолированный у C.fulvum той же группой исследователей, avr4. Его изучение также было начато с выделения белкового элиситора из апопластной жидкости томата, имеющего ген устойчивости С/4 и инфильтрированного спорами авирулентной расы.

Этот белок оказался более крупным (86 аминокислот), поэтому была определена последовательность только N-концевых аминокислот, что оказалось достаточным для конструирования полинуклеотида, использованного в качестве пробы для изоляции гена avr4. Его продукт — /?го-белок из 135 аминокислот с N-концевым сигнальным пептидом. Как и предыдущий белок, он подвергается в ходе созревания процессингу грибными и растительными протеазами, но имеет два отличия: 1) не имеет гомологий в компьютерном банке белков; и 2) у вирулентных рас кодирующий ген не делети- рован, а имеет толковые мутации, приводящие к замене одного цистеина






в положениях 64, 70 или 109 на тирозин (замена кодона TGT на TGA). Зрелый белок имеет 8 остатков цистеина соединенных дисульфидными связями и имеет гомологию с хитин-связывающим белком беспозвоночных. Он защищает Trichoderma viride и Fusarium solani от литического действия растительных хитиназ и, возможно, этим обусловлена его функциональная роль в патогенезе С. fulvum.
Проду1сг третьего гена авирулентности Avr2 — экстрацеллюлярный белок, состоящий из 58 аминокислот. 8 цистеиновых остатков этого белка

также соединены в узелок дисульфидными связями. Этот белок — ингибитор цистеиновых протеаз семейства папаина, в чем, возможно, заключается его функциональная роль в патогенезе.
Аналогичная методика выделения белков из межклеточной жидкости растений, зараженных несовместимыми расами, была применена группой американского фитопатолога У. Кногге для изучения генов авирулентно- сти возбудителя пятнистости листьев ячменя Rhinchosporium secalis. Этот гриб экскретирует in planta семейство мелких белков, названных NIP (necrosis /nducing proteins), неспецифически токсичных для однодольных и двудольных растений, вследствие стимуляции Независимой АТФ-азы плазмалеммы. Один из этих белков — NIP1 оказался расоспецифическим элиситором для сортов ячменя, имеющих ген устойчивости Rrs-1. Мутация, приводящая к замене одной аминокислоты в этом белке, устраняет несовместимую реакцию устойчивых сортов, но снижает патогенность даже в отношении восприимчивых сортов. Таким образом, NIP1-белок наряду со специфической авирулентностью выполняет роль фактора неспецифической патогенности. Изучение аминокислотных последовательностей мутантов и искусственно синтезированных олигопептидов показало, что детерминанты токсичности и индукции СВЧ-реакции находятся на разных концах молекулы. По-видимому, в растительной клетке содержатся разные рецепторы этих детерминант.
У гриба Pyricularia oryzae (телеоморфа Magnaporthe grizea) установлена структура нескольких avr-генов и кодируемых ими белков. Ген AVR-Pita локализован в теломерной области хромосомы, что обусловливает его нестабильность вследствие частых перестроек. (Нестабильность вирулентных рас этого гриба давно вызывала удивление фитопатологов; есть данные, что из одного пятна можно изолировать много моноспоровых штаммов, различающихся вирулентностью на сортах риса). Про-элиситор Avr-Pita состоит из 223 аминокислот, но после прохождения мембраны образуется аюпвный элиситор, имеющий 176 аминокислот. Функционально он представляет собой цинк-зависимую протеазу. Ген AVR-Pita экспрессируется на поздних этапах патогенеза, что связано, по-видимому, с необходимость использовать находящиеся в зараженной клетке белки для питания.
Другой яуг-белок — Acel оказался ферментом поликетидсинтетазой, участвующей в синтез вторичных метаболитов, имеющих поликетидную структуру (в частности — меланина). Этот белок не имеет доменов, обеспечивающих трансмембранный перенос (внутриклеточный белок), так что элиситорными свойствами обладает, по-видимому, продуцируемый им вторичный метаболит. 

Еще по теме Элиситоры грибов:

1. Общая характеристика грибов
2. Марфенина О.E.. Антропогенная экология почвенных грибов, 2005
3. Флора микроскопических грибов
4. Видовая идентификация грибов рода Malassezia.
5. Общая характеристика и классификация грибов-продуцентов микотоксинов
6. 2.1.14. Определение чувствительности культур грибов к антифунгальным препаратам.
7. Изучение ассимилятивных свойств грибов рода Malassezia по М. Crespo [58].
8. КОМПЛЕКС МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ В БОЛОТАХСЕВЕРНОЙ ТАЙГИ
9. 1.4. Питательные потребности грибов рода Malassezia и условия для их культивирования
10. Микрофлора молодых сосновых насаждений. Сукцессия видов грибов и бактерий.
11. 2.2.1.1. Сравнительная оценка методов выявления грибов рода Malassezia на покровных тканях животных
12. СИСТЕМАТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ГРИБОВ И БАКТЕРИЙ ПОДСТИЛКИ
13. ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ МИЦЕЛИЯ И СПОР ГРИБОВ В ТОРФЯНИКАХ