Ивермектины

Флуоресцентная дериватизация была использована другими исследователями для анализа ивермектина в плазме с применением более современных адсорбентов и средств выделения (S.E. Marriner et al., 1987; K. Kojima et al., 1987). С разработкой более чувствительного ультрафиолетового детектора метод ВЖХ был усовершенствован для определения ивермектина в крови при чувствительности 2 нг/мл (J.V. Pivnichny et al., 1983). Метод жидкостной хроматографии и ультрафиолетового обнаружения при чувствительности 4-5 нг/мл является удобным методом для обнаружения дигидроавермектина В]а и дигидроавермектина B!6. Этот метод используется для определения препарата в молоке коров при чувствительности 2 нг/мл (М. Alvinerie et al., 1987).

Для изучения метаболизма ивермектина в организме животных N.E. Weber (1980), H.W. Dorough (1980) разработали радиометрический метод обнаружения препарата. Препарат метаболи- зируется незначительно. Основная часть препарата обнаруживается в виде основного компонента авермектина Bja (H2Bia). Концентрация этой фракции в 10-20 раз выше содержания фракции авермектина В]б (H2Bi6).

Наиболее точным и надежным методом изучения фармакокинетики и остаточных количеств ивермектина в продуктах животного происхождения является метод жидкостной хроматографии высокого давления (ВЖХ) с флуоресцентным детектированием после проведения дериватизации (J.A. Bogan, Q.A. McKeller, 1988; С.В. Русаков, 1997).

Принцип метода основан на извлечении препарата из анализируемых проб мяса и органов этилацетатом, отгонке растворителя, очистке экстракта в системе ацетонитрил-гексан и на концентрирующих патронах Диапак-С-16 и Диапак-Амин с последующим определением жидкостной хроматографией высокого давления с флуоресцентным детектированием после дериватизации. Чувствительность метода - 4 нг/г.

Реактивы и растворы: этилацетат, х.ч,; гексан, х.ч.; концентрирующие патроны Диапак-С-16 и Диапак-Амин («БиоХим- Мак»); метанол, х.ч.; 1-метилимидазол, х.ч.; стандартный раствор ивермектина в метаноле с концентрацией 0,08 мкг/мл (0,00008 мг/мл).

Приборы и посуда: жидкостной хроматограф высокого давления типа Ди Pont 8800 (США) с флуоресцентным детектором Kratos Sthaeffel FS 950 (Великобритания); вакуумный ротационный испаритель; вакуумный испаритель со смесителем Vortex; баня для охлаждения; баня водяная с подогревом; ультразвуко- войдиспергатор УЗДН-1М; ротационный испаритель; аналитические весы; плоскодонные колбы с притертой пробкой емкостью 100 мл; круглодонные колбы со шлифом емкостью 50 мл; воронки химические; пробирки с притертой пробкой емкостью 30-40 мл; пробирки конусообразные емкостью 1 мл; автоматические пипетки на 5; 1 и 0,5 мл.

Ход анализа. Пробы мышц, печени, сердца, жира, почек, легких массой по 2 г и молока и крови по 2 мл, взятые у разных групп животных по 3-5 голов в каждой до и через 2, 4, 8, 12, 16 и 20 сут после введения препарата в дозе 0,2 мг/кг измельчали ножницами или в гомогенизаторе, помещали в плоскодонную колбу емкостью 100 мл, заливали 20 мл этилацетата и оставляли на сутки (тождественно экстракции при постоянном встряхивании в течение 1 ч).

Полученную ацетонитрильно-водную фракцию (1:2) наносили на патрон Диапак-С-16, предварительно последовательно активированный 5 мл ацетонитрила и 10 мл воды. Препараты элюировали с патрона Диапак-С-16 20 мл ацетонитрила через патрон Диапак-Амин, предварительно активированный 5 мл ацетонитрила, в круглодонную колбу. Элюент упаривали досуха на роторном испарителе.

Далее сухой остаток растворяли при флуоресцентном детекторе в 1 мл ацетонитрила.

Проведение дериватизации. В пробирку с сухим остатком вносили 0,5 мл ацетонитрила, энергично встряхивали и обрабатывали ультразвуком в течение 30 с. Затем пробирку повторно встряхивали и повторно обрабатывали ультразвуком, чтобы полностью перевести в раствор авермектины, адсорбированные на стенках пробирки.

Необходимо следить, чтобы в образцы перед проведением дериватизации не попала влага.

В пробирку с подготовленным ацетонитрильным раствором после растворения вносили с помощью градуированной микропипетки 0,05 мл 1-метилимидазола. Пробирку закрывали, тщательно перемешивали содержимое в течение 5-10 с, обрабатывали ультразвуком, центрифугировали и помещали в холодильник при 0 °С на 10-15 мин. Готовили реакционную смесь из трифто- руксусного ангидрида и ацетонитрила в соотношении 1 : 2 и помещали ее в холодильник при 0 °С на 10-15 мин.

После охлаждения в пробирку с образцом вносили 0,150 мл охлажденной реакционной смеси. Пробирку закрывали, перемешивали содержимое, обрабатывали ультразвуком, центрифугировали и выдерживали в холодильнике в течение 1 ч.

Условия хроматографирования проб с авермектином и обработка результатов: жидкостной хроматограф Ди Рогй 8800 (США) с флуоресцентным детектором Kratos-Sthaeffel ББ 950 (Англия); металлическая колонка Диасорб-130-С 16Е 250x4 мм, 6 мм («БиоХимМак», Россия); подвижная фаза метанол:вода (98 : 2); скорость подвижной фазы 2 мл/мин.; длина волн возбуждения 365, эмиссии 470 нм; время удерживания Н2В1б 16,6, Н2В,а 18,6 мин.

Содержание авермектина в анализируемых пробах рассчитывали по формуле (1), гдеХ- содержание авермектина в анализируемой пробе, нг/г; 1$\ - площадь пиков фракции Н2В1а в стандарте, мм2; $2 - площадь пиков фракции Н2В1б в пробе, мм2; С - количество стандарта в пробе, вносимой в хроматограф, нг; V] - объем пробы, вносимой в хроматограф (50 мкл); У2 - общий объем пробы (0,7 мл); Р - масса анализируемой пробы, г.

Для изучения фармакокинетики ивермектина разработаны разные методы его выявления в органах и тканях, сыворотке крови и молоке. Однако многие методы из-за своей сложности и недостаточной чувствительности малоэффективны.

А.В. Григорьев и др. (2004) разработали методику определения ивермектина в сыворотке крови животных и продуктах вете- ринарно-санитарного надзора после применения различных лекарственных форм на основе ивермектина.

Метод определения концентрации ивермектина в крови и молоке животных основан на определении количественного содержания флуоресцентного производного ивермектина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой с применением флуоресцентного детектора.

Подготовка проб заключается в экстракции ивермектина органическим растворителем из исследуемого образца животного происхождения, очистке путем твердофазной экстракции и получении флуоресцентного производного ивермектина обработкой трифторуксусным ангидридом в присутствии 1 -метил-имидазола.

Детектирование ведется по интенсивности флуоресценции при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм, соответственно. Чувствительность метода составляет 2 нг в пробе, нанесенной на колонку.

Пробы крови в объеме 9 мл отбирали в центрифужные пробирки, содержащие 1 мл 3 % Ка2ЭДТА, 0,9 % NaCl и 500 нг аба- мектина. Полученные образцы центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Затем 1 мл плазмы помещали в центрифужную пробирку, добавляли 2 мл метанола, тщательно перемешивали на Vortex и центрифугировали 30 мин при 6000 об/мин. Супернатант фильтровали через мембранный фильтр (размер пор 0,45 мкм) типа «Свиннекс» и наносили на патрон для твердофазной экстракции Chromabond С8 100 mg, предварительно промытый 1 мл метанола. Промывка патрона и нанесение образцов осуществляли самотеком. Раствор после патрона отбрасывали. Патрон сушили азотом 2 мин при 5 атм. и промывали 1 мл метилтретбутилового эфира. Элюат собирали в пробирку с притертой пробкой. В элюат добавляли 50 мкл 1-метил-имидазола, перемешивали, вносили 50 мкл трифторуксусного ангидрида, перемешивали еще раз и отстаивали до образования маслообразного осадка и просветления надосадочного слоя. Из надосадочного слоя осторожно отбирали 100 мкл раствора и переносили в пробирку с притертой пробкой, содержащую 1 см3 ацетонитрила. После проведения всех вышеперечисленных процедур образец готов для ВЭЖХ анализа.

В качестве стандартных растворов используют шесть образцов крови с известными концентрациями ивермектина и аба-

мектина. Для этого в центрифужных пробирках готовят шесть водных растворов объемом 1 мл, содержащих 3 % Ыа2ЭДТА, 0,9 % NaCl, ивермектин (0, 10, 50, 100, 500, 1000 нг, соответственно) и абамектин 500 нг. pH растворов доводят до 7,4 раствором NaOH. Ивермектин и абамектин добавляют в виде аликвот ацето- нитрильных растворов. Конечное содержание ацетонитрила не должно превышать 0,1 % для предотвращения гемолиза крови.

В пробирки с приготовленными растворами отбирали по 9 мл крови, получая шесть стандартных образцов крови с концентрациями ивермектина 0, 1,5, 10, 50, 100 и абамектина 50 нг/мл. Дальнейшую подготовку проб проводили аналогично образцам крови.

Хроматографический анализ проводили на ВЭЖХ системе «Стайер», состоящей из ВЭЖХ насоса серии 2, флуориметриче- ского детектора модели 121, колонки Luna С 18(2) 5 цш 150x2,0 mm. Подвижная фаза - ацетонитрил: метанол -5:4, скорость потока 300 мкл/мин. Объем инжектируемой пробы 20 мкл. Детектирование вели по интенсивности флуоресценции производных ивермектина и абамектина (компоненты В]а) при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм соответственно.

Для получения достоверных результатов проверяют линейность калибровочной кривой, построенной по отношению площадей хроматографических пиков ивермектина и абамектина (компоненты Bia) от концентрации ивермектина.

Строят кривую зависимости коэффициента аппроксимации kf от содержания ивермектина в стандартном образце крови. Для этого kj рассчитывают по формуле

^ихС'см

где 5^ст - площадь хроматографического пика абамектина в стандартном образце крови; С1 ст - содержание ивермектина в стандартном образце крови, нг/мл; 81ст - площадь хроматографического пика ивермектина в стандартном образце крови.

Полученную зависимость аппроксимировали (достоверность аппроксимации Я2gt;0,98) по уравнению

к[ = а х 1п{С1 ст) + Ь,

где а, Ь - эмпирически подобранные константы; С1 ст - концентрация ивермектина в стандартном образце крови, нг/мл.

Средний коэффициент ^ рассчитывают по формуле

ЪикП */ = —.

п

где к$ - коэффициент, соответствующий ьму стандартному образцу крови; п - количество стандартных образцов крови, содержащих ивермектин.

Содержание ивермектина (нг/мл) в исследуемом образце крови находят по формуле

Г(1              гг/

° обр              обр

С = (ах 1п (              х А/) + Ъ)               ,

^пбр              ^обр х 0,9

где Б1 обр - площадь хроматографического пика ивермектина в исследуемом образце крови; йобр - площадь хроматографического пика абамектина в исследуемом образце крови; а, Ь - эмпирические константы, вычисленные ранее; kf- средний коэффициент, вычисленный ранее; 0,9 - коэффициент разведения.

Метод определения содержания ивермектина в молоке аналогичен методу определения содержания его в крови, за исключением того, что антикоагулянт (Ыа2ЭДТА) не применяют и пробы молока не центрифугируют.