Бензимидазолы

Оксфендазол. Оксфендазол и продукты его метаболизма в органах и тканях животного происхождения обнаруживали методом жидкостной хроматографии высокого давления (С.Ф.

120

Методика основана на извлечении оксфендазола и его метаболитов из гомогената анализируемых проб этилацетатом, очистке экстракта перераспределением в системе ацетонитрил-гексан и количественном определении методом жидкостной хроматографии высокого давления с использованием в качестве внутреннего стандарта раствора мебендазола. Чувствительность метода - 0,05 мг/кг, определяемость - 80±5 %.

Реактивы и растворы. Физиологический раствор. 25%-ный раствор аммиака. Бромистый калий (КВг). Этилацетат х.ч. Ацетонитрил х.ч. Гексан х.ч. Диметилсульфоксид (ДМСО) х.ч. 0,05 М раствор углекислого аммония ((МН4)2С03) 4,5 г/л). Стандартный раствор мебендазола с концентрацией 500 мкг/мл (50 мг препарата растворяют в 100 мл ДМСО).

Приборы и посуда. Гомогенизатор. Ротационный вакуумный испаритель. Весы аналитические. Делительные воронки емкостью 25 мл или цилиндрические пробирки с притертой пробкой емкостью 25 мл. Круглодонные колбы емкостью 25 и 50 мл. Мерные цилиндры емкостью 50 и 100 мл. Автоматические пипетки на 100 мкл и 5 мл. Пробирки Эппендорфа на 0,5 мл. Жидкостной хроматограф типа НРР 5001 (ЧССР). Настольная центрифуга типа ОПн-8УХЛ4.2.

Ход анализа. Анализируемую пробу животной ткани (мышцы, печень, почки, селезенка и др.) измельчают и делают навеску в 2 г. Измельченную пробу гомогенизируют в 10 мл физиологического раствора. В гомогенат вносят 2 г КВг и 1 каплю 25%-ного раствора аммиака. Добавляют 10 мл этилацетата, осторожно перемешивают, не допуская образования эмульсии. Органическую фазу переносят в круглодонную колбу. Переэкстракцию повторяют дважды. Этил ацетатные экстракты объединяют в круглодонной колбе и упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С досуха.

Условия хроматографического анализа. Жидкостной хроматограф высокого давления типа НРР 5001 (ЧССР). Колонка с 8е~ paron С-18 (5 мкм) длиной 150 мм и внутренним диаметром 3,3 мм. Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,05 М раствор (NH4)2C03 в соотношении 33 : 65 (объем/объему). Скорость подвижной фазы

0. 4 мл/мин. Давление 22 мРа. Объем вводимой в хроматограф пробы 5-8 мкл. Длина волны анализа 290 нм. Время удерживания: оксфендазол - 5’0", сульфон оксфендазола - 8’20", мебендазол-12’30м.

Обработка результатов анализа. Содержание оксфендазола и его метаболитов в анализируемой пробе рассчитывают по формуле 5*2 х С х V,

Х=-              , (1)

S\xPxV)

где X - содержание оксфендазола и его метаболитов в анализируемой пробе, мкг/г или мг/кг; Si - площадь пика внутреннего стандарта (мебендазола), мм2; S2 - площадь пика оксфендазола и его метаболитов, мм2; С - количество внутреннего стандарта в пробе, вносимой в хроматограф, мкг или мг; V\ - объем пробы, вносимой в хроматограф (5 или 8 мкл); V2 - общий объем пробы (300 мкл); Р - масса анализируемой пробы, г или кг.

Хроматографический метод количественного анализа албендазола и албендазола сульфоксида в пробах животного происхождения с нижним пределом измерения для печени 125,691, почек

• 121,743 нг/г разработан С.Н. Максименко (2007). Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью ±5 % при доверительной вероятности - 0,95.
  Метод основан на извлечении албендазола и албендазола сульфоксида из гомогена- та анализируемых проб этилацетатом, очистке экстракта перераспределением в системе ацетонитрил - гексан и количественном определении методом жидкостной хроматографии высокого давления.

Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы. Средства измерения: жидкостной хроматограф высокого давления Helwett-Packard 1090 с диодно-матричным детектором, управляемым при помощи 79994A Chem Station; весы аналитические 2-го класса точности, ГОСТ 24104-88; весы микроаналитические, точность взвешивания до 4-го десятичного знака, Chen (США) или аналогичные; автоматические пипетки, ТУ 64-1-3329-81; колбы мерные вместимостью 100 мл, ГОСТ 1770- 74; шприц Гамильтона (Швейцария).

Вспомогательные устройства: холодильник; роторный испаритель; сушильный шкаф; цилиндрические пробирки с притертой пробкой емкостью 50 мл; круглодонные колбы емкостью 25 и 50 мл; пробирки на конус (Эппендорфа на 1 или 0,5 мл); стандартные образцы албендазола фирмы Invesa. Активность 99,7 %.

Реактивы: этилацетат х.ч.; ацетонитрил х.ч.; гексан х.ч.; диме- тилформамид (ДМФА) х.ч.; сульфат натрия (Na2SCgt;4) безводный.

Требования безопасности:

1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88;
2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76;
3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с высшим и средним специальным образованием, имеющих навыки работы с химическими реагентами и на жидкостном хроматографе.

Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха 20±10 °С, атмосферном давлении 84-106 кПа и влажности воздуха не более 80 %. Измерения на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Стандартный раствор албендазола с концентрацией 20000 нг/см (раствор № 1) готовят путем растворения точной навески стандартного образца в диметилформамиде. Раствор хранится в течение 14 сут в холодильнике. Рабочие стандартные растворы албендазола готовят путем последовательного разведения диме- тилформамидом до концентраций 10000, 5000, 2500, 1000, 500 нг/мл.

Общую подготовку прибора осуществляют согласно инструкции по зксплуатации.

Параметры хроматографирования: Жидкостной хроматограф высокого давления Helwett-Packard 1090 с диодноматричным детектором, управляемым при помощи 79994А ChemStation. Элюент: ацетонитрил/аммонийно-ацетатный буфер (40/60). Колонка хроматографическая: Micra С 18 ODS (2,0x40,0 мм) с размером сорбента 1,5 (um. Скорость протекания элюента - 1,0 мл/мин. Давление: 16,2 МПа. Объем вводимой пробы - 0,050

мл. Длина УФ-волны детектирования: 290 нм. Время удерживания албендазола: - 7,5 мин. Время удерживания албендазола сульфоксида: ~ 6,5 мин.

Статистическая обработка результатов анализа проб печени и почек. По результатам анализа стандартных концентраций албендазола построили график зависимости площади пика от концентрации (рис. 6.1.).

Площадь пика, тУх ? Концентрация, нг/см

Рис. 6.1. Площадь пика-концентрация (стандартные растворы)

В результате было получено следующее уравнение, отражающее данную зависимость:

Г-47,526 X X

Для определения процента извлечения албендазола в образцы, отобранные от животных контрольной группы, искусственно внесли стандартные растворы албендазола и албендазола сульфоксида из расчета 2500 нг/г биосубстрата. Результаты анализа данных образцов приведены в таблице 6.1.

1. Степень извлечения албендазола из экстрактов печени и почек

Подготовка проб к определению. Экстракция и очистка экстрактов, органы и ткани. До проведения анализа пробы хранят при - 20 °С. Анализируемую пробу животной ткани (печень, легкие, сердце, мышцы и др.) размораживают, измельчают тщательно ножницами, взвешивают и переносят в цилиндрическую пробирку с притертой пробкой, добавляют 20-30 мл этилацетата и оставляют на 10-12 ч. Затем экстракт переносят через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия в круглодонную колбу. Навеску пробы заливают второй порцией этилацетата (10-20 мл) и оставляют на 1 ч при периодическом встряхивании, экстракт также переносят через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия в круглодонную колбу.

Этилацетатный экстракт упаривают в ротационном испарителе досуха при температуре 40-50 °С. Сухой остаток дважды смывают 10 мл ацетонитрила и переносят в другую пробирку с притертой пробкой емкостью 50 мл. В пробирку добавляют 15 мл гексана, содержимое осторожно переворачивают примерно 30 раз. После разделения слоев автоматической пипеткой (5 мл) верхний гексановый слой отсасывают и отбрасывают. Переэкстракцию повторяют трижды, во всех случаях гексановый слой отбрасывают. Нижний ацетонитрильный слой количественно пе

реносят в кругло донную колбу емкостью 25 мл. Органический растворитель отгоняют в ротационном испарителе при температуре 40 °С досуха. В колбу вносят 200 мкл диметилформамида (ДМФА), остаток растворяют и переносят в пробирки Эппендор- фа. Пробы до анализа хранят при - 20 °С.

Хроматографирование полученных экстрактов проводили вышеописанным методом.

Выполнение измерений. Анализ включает не более 10 испытуемых образцов. Перед началом и в конце работы проводят анализ стандартного образца, чтобы убедиться в стабильности работы системы. Объем наносимой на колонку пробы для всех объектов составляет 0,050 мл.

Обработка результатов. Для обработки результатов хроматографирования используется программа «БагаВаБе Вю81аЙ8Йс 4.02 уз». На хроматограммах исследуемых образцов определяют площадь пиков, по времени удерживания соответствующих пикам стандарта албендазола.

По калибровочному графику находят содержание албендазола в объеме инжектируемой пробы испытуемого образца.

6.2.

  Площадь пика-концентрация (стандартные раствор

где Ска концентрация албендазола в образце, нг/г; S значение площади пика с хроматограммы (%); К - коэффициент, учитывающий степень извлечения албендазола (получен при постановке модельных опытов с внесением известных количеств албендазола сульфоксида), для печени

• 59,736048, почек - 57,859751; т - масса навески печени или почек

Содержание албендазола сульфоксида определяют пересчетом, исходя из молекулярной массы, по формуле

Мс

с = с              

^ кс ка              5

М

где Скс - концентрация албендазола сульфоксида в образце, нг/г; Ска - концентрация албендазола в образце, нг/г; Мс - молекулярная масса албендазола сульфоксида (281,3); Ма - молекулярная масса албендазола (265,3)

Фенбендазол. С.В. Русаков, П.П. Диденко, Зуев (2006 ) разработали метод определения остаточных количеств фенбендазола и его метаболита - оксфендазола, который является основным противопаразитарным агентом, в органах и тканях свиней после обработки препаратом Фензол (новая лекарственная форма анти- гельминтика на основе фенбендазола, разработанная ВИГИС, П.П. Диденко).

При разработке методики за основу взяты широко используемые методы экстракции и очистки проб (S. Marriner, J. Bogan 1980; P. Delatour, 1983), параметры хроматографирования были подобраны в процессе работы с учетом особенностей имеющегося хроматографа, хроматографической колонки и реактивов.

Принцип метода. Метод основан на хроматографировании с использованием жидкостного хроматографа высокого давления с ультрафиолетовым детектором, обращеннофазовой колонки и программы Мультихром (версия 1.5), достаточного для анализа количества экстрактов, полученных после экстракции этилацета- том проб плазмы крови, печени, почек, сердца, поджелудочной железы, легких, селезенки, мышечной ткани, жировой ткани, лимфоузлов, матки, тонкого и толстого кишечника, очистки экстрактов в системе «ацетонипгрил-гексан» и концентрирования очищенных экстрактов.

Оборудование, посуда, реактивы: стандарт фенбендазола с активностью 99,8 % («Jangsu Jabang Group»); стандарт оксфенда- зола с активностью 95,4 % («Jangsu Jabang Group»); жидкостной хроматограф высокого давления Hewlett Paccard 1090 А с УФ- детектором или аналогичный по техническим характеристикам; хроматографическая обращеннофазовая колонка LUNA С 18 (250 х 4,6 мм) с диаметром сорбента 5 мкм или аналогичная; весы лабораторные, ГОСТ 24104; рН-метр Hanna pH 213; вакуумный ротационный испаритель IKA RV 06 ML 1-В или аналогичный по техническим характеристикам; центрифуга лабораторная ОПН-3 или аналогичная; ультразвуковая ванна Branson В 8510 DTH или аналогичная; встряхиватель Elmi (Шейкер S-3.01) или аналогичный; посуда мерная, лабораторная стеклянная, ГОСТ 1770; вода дистиллированная, ГОСТ 6709; бромид калия 99,0 %, Р0838 («Sigma»); углекислый аммоний двузамещенный А 9516 («Sigma»); водный раствор аммиака 30 % 22,122-8 («Sigma- Aldrich»); этилацетат х.ч., ГОСТ 22300-76 («Борис-Авогадро»); ацетонитрил, ч.д.а., ТУ 6-09-5497 («Криохром»): гексан, ч., ТУ 6- 09-337578 (АО «Мосреактив»).

Подготовка к анализу. Приготовление элюента. 0,05 М раствор углекислого аммония (4,8045 г/1000 мл воды) смешивали с ацетонитрилом в соотношении 65 : 35 и фильтровали через бумажный фильтр непосредственно перед использованием.

Настройка хроматографа. Для ввода хроматографической системы в рабочий режим колонку LUNA С 18 (250 х 4,6 мм) промывали элюентом в количестве 15 свободных объемов колонки при скорости протекания элюента 0,3 см3/мин. После окончательного уравновешивания колонки устанавливали УФ-волну анализа на 290 нм.

Приготовление рабочих стандартных растворов. На аналитических весах взвешивали по 10,0 мг (точные навески с учетом активности) фенбендазола и оксфендазола, навески переносили в общую мерную колбу объемом 100 см3, добавляли 50 см3 элюента и тщательно перемешивали до полного растворения. Затем объем раствора водой доводили до метки. Полученная концентрация исходного раствора - 100 мкг/см3 по каждому из компонентов. Из исходного раствора методом последовательных разведений готовили стандартные растворы с концентрацией 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см3 по фенбендазолу и оксфендазолу.

Подготовка проб к аначизу. В образцы (плазма крови, печень, почки, сердце, поджелудочная железа, легкие, селезенка, мышечная ткань, жировая ткань, лимфоузлы, матка, тонкий и толстый кишечник) массой 5 г добавляли 10 см3 физиологического раствора и гомогенизировали в течение 3-5 мин при 5000 об/мин.

Полученный гомогенат количественно переносили в делительную воронку и помещали в резервуар со льдом. В охлажденный гомогенат вносили 2 г бромида калия и титровали pH до 8-9 при помощи 25%-ного водного аммиака, после чего пробу тщательно перемешивали. Далее, к гомогенату добавляли 10 см' этилацетата, пробу экстрагировали при постоянном перемешивании в течение 1 ч. Затем для разделения слоев полученную эмульсию центрифугировали в течение 5 минут при 5000 об/мин. Экстракцию каждой пробы этилацетатом с последующим центрифугированием проводили трехкратно. После центрифугирования слои этилацетата переносили в круглодонную колбу для последующего упаривания. Объединенные этилацетатные экстракты упаривали досуха на ротационном испарителе при температуре +40 °С. Полученный после упаривания сухой остаток растворяли в 10 см3 ацетонитрила при одновременной обработке ультразвуком. Ацетонитрильный раствор переносили в пробирку объемом 25 см3 и промывали 3-5- кратно порциями по 8 см гексана. Гексановые фракции отбрасывали, а ацетонитрильную фракцию, промытую гексаном, переносили в круглодонную колбу объемом 50 см3 и упаривали досуха на ротационном испарителе при температуре +50°С. Полученный после упаривания сухой остаток растворяли в 0,5 см3 элюента при одновременной обработке ультразвуком для последующего анализа методом жидкостной хроматографии высокого давления.

Параметры хроматографирования. Наиболее оптимальные результаты анализа были получены при следующих хроматографических параметрах:

Обращеннофазовая хроматографическая колонка LUNA С 18 (250 х 4,6 мм) с диаметром сорбента 5 мкм. Элюент: ацетонитрил/0,05 М раствор углекислого аммония в соотношении 35/65. Скорость протекания элюента - 0,5 см3/мин. Давление: 18,4 МПа. Объем вводимой пробы - 50 мкл. Спектр УФ-волны: 290 нм.

Определение метрологических характеристик метода. Для проведения качественного и количественного анализа полученных экстрактов применяли процедуру градуировки хроматографических данных в компьютерной программе «Мультихром 1.5».

Для построения графика корреляции площади пика и концентрации использовали ряд стандартных разведений фенбенда- зола и оксфендазола 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см , приготовленных по схеме, приведенной выше. Результаты, полученные при определении корреляции «площадь пика/концентрация» представлены в таблице 6.2.

6.2. Зависимость площади пика от концентрации

Уравнения, полученные для линий тренда фенбендазола и оксфендазола, и в частности, величины достоверности аппроксимации (Я2), приближенные к единице, свидетельствуют о высокой степени линейной зависимости площади пика от концентраций компонентов и, следовательно, о высокой достоверности получаемых результатов (рис. 6.2).

Рис. 6.2. Калибровочный график

Определение уровня извлечения фенбендазола и оксфендазо- ла из проб. Определение уровня извлечения фенбендазола и окс- фендазола проводили на контрольных пробах. В плазму крови объемом 2 см3, а также гомогенаты проб органов и тканей массой

5. г вносили по 1 см3 стандартного раствора фенбендазола и окс- фендазола с концентрацией 5 мкг/см3. После внесения стандартных растворов пробы тщательно перемешали. Пробоподготовку проводили по отработанной методике. Объем конечных экстрактов модельных проб составлял 1 см3. Результаты определения уровней представлены в таблицах 6.3 и 6.4.

Определение пределов детектирования. Пределы детектирования фенбендазола и оксфендазола в экстрактах определяли хроматографированием модельных проб плазмы крови, печени, почек, сердца, поджелудочной железы, легких, селезенки, мышечной ткани, жировой ткани, лимфоузлов, матки, тонкого и толстого кишечника с внесенными стандартными образцами различной концентрации.

3. Определение уровня извлечения фенбендазола (концентрация

5. мкг/см3, площадь стандарта 469,462)

4. Определение уровня извлечения оксфендазола (концентрация

5. мкг/см3, площадь стандарта 447,595)

В результате получили следующие значения пределов детектирования фенбендазола и оксфендазола в экстрактах (нг/г)

Фенбендазол

При помощи процедуры градуировки, выполненной в соответствующем разделе компьютерной программы «Мультихром 1.5», определяют относительные коэффициенты отклика детектора для анализируемых экстрактов и получают формулы расчета содержания фенбендазола и оксфендазола в экстрактах (У)

Фенбендазол

плазмы крови              0,0573684 х X