ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЕННОЙ БИОТЫ

Метод стекол обрастания. «Микробный пейзаж» может быть получен методом стекол обрастания Росси — Холодного,, который заключается в следующем. В небольшом почвенном разрезе одну из стенок зачищают и, делая ножом вертикальную щель, закладывают в нее стерильные предметные стекла, плотно прижимая их к почве.

Модификация метода заключается в том, что стекла перед помещением в почву покрывают какой-нибудь питательной средой (крахмало-аммиачным агаром, например, согласно модификации А. В. Ры- балкиной и Е. В. Кононенко) или специфическим субстратом (например, фильтровальной бумагой, льняной тканью и т. д.).

Метод капиллярных педоскопов. В естественных условиях развитие микроорганизмов происходит в основном в почвенных капиллярах, к стенкам которых прикрепляются.

Стерильные педоскопы вставляют в почву с помощью специального пробойника так, чтобы каналы капиллярных ячеек приняли вертикальное положение, т. е. соответствовали преобладающему направлению тока почвенного раствора. Экспозиция педоскопов в почве длится обычно в течение месяца, после чего педоскопы вынимают из почвы, очищают снаружи от почвенных частичек и рассматривают под микроскопом с иммерсионной системой объектива. Микробы в иедоскопах могут быть зафиксированы и окрашены. Фиксируют их в парах осмиевой кислоты или в парах 40%-ного раствора формалина. Окрашивают 1%-ным раствором карболового эритрозина, промывают водой.

Модификация метода, предложенная Т. В. Аристовской, состоит в том, что внутренние стенки капилляров покрывают средой, содержащей ту или иную фракцию гуминовых кислот. 50 г почвы заливают 1 л 0,1 н. раствора NaOH и через 18—20 ч отфильтровывают. Реакция среды должна быть слабокислой, pH фильтрата осторожно доводят 0,2 н. НС1 до 5. Затем в фильтрат по капле прибавляют 20%-ный раствор FeCU до полного выпадения гумусовых веществ в форме геля, который отфильтровывают и отмывают от следов хлора (проба с 1%-ным раствором AgN03). Около 5 мл геля растирают в ступке, взбалтывают в 1 л воды, вносят в 0,1%-ный раствор агара и стерилизуют. Педоскоп

боковой стороной помещают в расплавленную среду, тщательно протирают снаружи стерильной ватой, подсушивают.

Метод люминесцентно-микроскопического наблюдения микроорганизмов в почвенных монолитах по Звягинцеву. Приготовляют цилиндрическую формочку размером 1x1 см из нержавеющей стали, пластмассы или стекла, имеющую острые края. Вдавливают формочку в почву исследуемого горизонта и осторожно вынимаюд ее так, чтобы над краями формочки возвышался слой'почвы.

Электронно-микроскопические исследования почвенных микроорганизмов. Разрешающая способность электронных микроскопов достига- •ei 2 А. Современные электронные микроскопы позволяют увидеть даже атомы тяжелых металлов. В настоящее время получили распространение два типа электронных микроскопов: просвечивающие или трансмиссионные ‘(ТЭМ), в которых исследуемый объект просвечивается пучком электронов, создающим затем на экране или фотопластинке соответствующее изображение, и растровые, или сканирующие (СЭМ), в которых изображение создается вторичными электронами, испускаемыми исследуемой поверхностью при облучении ее пучком первичных электронов. Электронные микроскопы просвечивающего типа отличаются более высокой разрешающей способностью, однако они пригодны только для изучения очень тонких образцов (с толщиной, не превышающей 500 А). Поэтому в микробиологии и почвоведении более широкое применение находит растровая электронная микроскопия, позволяющая исследовать непрозрачные объекты. В растровом электронном микроскопе высокая разрешающая способность сочетается с большой глубиной резкости, широким полем зрения и большим диапазоном увеличений.

Подготовка препаратов для электронной микроскопии — сложный и трудоемкий процесс. Подложка препаратов для микроскопов просвечивающего типа должна быть очень тонкой (10—15 мкм) и проницаемой для электронов. Такие пленки изготовляют из коллодия, формвара, угля и кварца и помещают на металлические сетки. Диаметр предметных сеток равен 2—3 мм. На пленки наносят суспензию микроорганизмов и после испарения воды препарат просматривают.

Основное требование, предъявляемое к образцам для растровой электронной микроскопии, — максимальное сохранение их первона-

чальной структуры. Это требование осложняется тем, что наблюдение на" растровом электронном микроскопе ведется в условиях вакуума и образец находится под действием электронного пучка. Кроме того, препараты для растрового электронного микроскопа должны быть электропроводными, поэтому исследуемые диэлектрические препараты необходимо напылить металлами, препятствующими зарядке поверхности или обеспечивающими стекание зарядов с поверхности образца. Препарирование образцов для растрового электронного микроскопа включает ряд операций, в том числе дегидратацию и высушивание образцов без нарушения их морфологической структуры и напыление поверхности тяжелыми металлами. Исследуют образцы, не превышающие 10 мм в диаметре, поверхность образца не должна иметь больших неровностей, так как наличие неровностей сказывается на фокусе изображения и препятствует равномерному напылению образца металлом. Высушенные образцы наклеиваются на металлические столбики и после напыления металлом просматриваются под микроскопом.

Методы исследования адсорбции почвенных микроорганизмов. Для изучения адсорбции микроорганизмов почвенными частичками пользуются косвенными и прямыми методами. Метод Диановой и Ворошиловой заключается в следующем. В большую пробирку вносят 5 г почвы и 1 мл бульонной культуры исследуемого микроорганизма. Такое же количество клеток вносят в другую пробирку, не содержащую почвы. Затем в обе пробирки вносят по 9 мл стерильной водопроводной воды. После минутного встряхивания и 10-минутного отстаивания из верхнего слоя жидкости обеих пробирок производят посев на питательную среду для учета количества микроорганизмов.

Применение метода люминесцентной микроскопии дает возможность видеть адсорбированные клетки непосредственно на почвенных частицах (Звягинцев, 1973). Поскольку большинство микробиологических объектов не обладает собственной люминесценцией или обладает ею в слабой степени, микроорганизмы окрашивают обычно специальными красителями-флуорохромами (например, акридином оранжевым), которые обусловливают свечение клеток. При проведении работы важно точно подобрать оптимальную концентрацию красителя. Только в этом случае клетки будут достаточно хорошо видны. Например, можно подобрать такую концентрацию, когда почвенные частицы светятся красным, а адсорбированные на них клетки — зеленым. Опыты проводят с применением отраженного света. Иногда свечение почвенных частиц затрудняет рассмотрение прикрепленных к ним клеток микроорганизмов, особенно при рассмотрении почвенных монолитов, где почвенные частицы составляют сплошной светящийся фон. Ослабление свечения фона достигается применением тушителей (например, пирофосфата натрия 0,5—1%).

Большие возможности для изучения адсорбции микроорганизмов б почве дает сканирующая электронная микроскопия. При использовании сканирующего электронного микроскопа удается видеть отдельные адсорбированные клетки микроорганизмов и их микроколонии.