ДИАГНОСТИКА

Все формы лейкоза характеризуются увеличением в различной степени лимфоузлов. При лимфолейкозе они увеличены равномерно, не сращены с окружающими тканями, капсула снимается легко, на разрезе узлы серо-белого цвета, сочные и саловидные. Лимфоузлы при лимфогранулематозе, лимфосаркоме и гистиоцитарной саркоме бугристые, капсула сращена с паренхимой, на разрезе часто обнаруживают кровоизлияния и некрозы; в органах брюшной, тазовой полостей, на серозных оболочках отмечают опухолевые разрастания узлов в виде конгломератов серо-белого, желто-серого цвета. Селезенка при лимфоидном, слабодифференцированном и миелоидном лейкозах увеличена. При первых 2-х формах она буро-красного цвета с четко выраженной красной и белой пульпой за счет гиперплазии фолликулов. В более поздней стадии болезни граница между белой и красной пульпой стерта. При миелоидном лейкозе селезенка красно-малинового цвета, фолликулы плохо заметны, а в отдельных участках отсутствуют, ткань рыхлой консистенции с кровоизлияниями. При лимфоретикулосаркоме селезенка не увеличена. При всех формах лейкоза отмечают очаговые или диффузные разрастания серо-белого или серо-розового цвета в печени, почках, толще сердечной мышцы, органах пищеварения, матке, скелетных мышцах, диафрагме и других органах.

Взятие и подготовка материала. Для гематологического исследования кровь берут из яремной вены в пробирки с антикоагулянтом - 10 %-ном р-ром динатриевой соли этилен- диамингетрауксусной кислоты (ЭДТА, трилон В) из расчета 0,02 мл р-ра на 1 мл крови. Не разрешается брать кровь от животных за 15 дней до отела и 15 дней после него. Для серологического исследования кровь берут от животных в возрасте 6 мес и старше. В лабораторию в термосе со льдом направляют 5-6 мл сыворотки. Для гистологического исследования кусочки пораженных органов (селезенки, лимфоузлов, грудной кости, печени, почек, легких, сердца и правого ушка сердечной мышцы, стенки сычуга, матки и скелетных мышц) посылают в свежем виде в термосе со льдом или в 10%-ном р-ре формалина.

Индикация и идентификация вируса

Для определения вируса в различных материалах используют методы, позволяющие выявлять инфекционный вирус или вирусные АГ. Являясь типичным ретровирусом, ВЛКРС находится у инфицированных животных в форме провирусной ДНК, которую можно выявить в лимфоцитах крови с помощью ПЦР или методами гибридизации нуклеиновых кислот. При культивировании инфицированных клеток вирус можно выявить с помощью электронного микроскопа или по образованию синцития в соответствующих индикаторных культурах (34).

Электронно-микроскопический метод. Позволяет 'выявлять вирусные частицы в краткосрочных культурах лейкоцитов крови животных, инфицированных ВЛКРС, и в монослойных культурах клеток, сокультивированных с инфицированными лимфоцитами. По некоторым данным, лейкоцитарные культуры (лейкоциты крови больных коров) через 48-72 ч представлены разнообразными клетками, среди которых находили лимфоциты и лимфобласты, продуцирующие вирусные частицы типа С. Зрелые вирионы имели ультраструктуру, типичную для онковируса типа С. Вирусные частицы находили, в основном, в межклеточных пространствах и на внешней мембране лимфоидных клеток. Методом ЭМ у больных лейкозом животных обнаруживают в лимфоцитах ядерные “карманы” в виде неправильного кольца и петли. Как правило, они обладают связью с оболочкой ядра и содержат цитоплазматическое вещество клетки. Иногда центральная часть их заполнена электроннолотными гранулами диаметром 4 нм, расположенными группами и напоминающими гранулы гликогена. Ядерные “карманы” отсутствуют в дифференцированных гранулоцитах, моноцитах и плазматических клетках; в одном лимфоците их обнаруживают 1-5 и более.

Тест синцитиеобразования. ТСО применяется для выявления инфекционного вируса в различных материалах и основан на способности ВЛКРС образовывать синцитии в некоторых нетрансформироваиных монослойных культурах клеток и в трансформированных перевиваемых культурах клеток СС81. Метод предложен для титрования ВЛКРС с использованием кошачьей линии клеток S4!/. Показано, что инокуляция клеток вирусом лейкемии КРС приводит к образованию крупных многоядерных сиицитиев, которые выявляются при окрашивании монослоя. Метод можно использовать для титрования вируса, так как имеется прямо пропорциональная зависимость между уменьшением количества синцитиев и разведением вирусной суспензии. Метод является воспроизводимым, специфическим и чувствительным. Рекомендуют микромодификацию метода количественной титрации инфекционного ВЛКРС, основанную на определении количества синцитиев в культуре эмбриональных клеток теленка, культивированной с лимфоцитами, зараженными вирусами лейкемии КРС, или в присутствии вируса. Отмечена линейная зависимость между числом инокулированных в культуре клеток зараженных вирусом лейкоцитов и количеством индуцированных синцитиев. При сравнении чувствительности макро- и микрометода титрации число синцитиев в микрокультуре статистически не отличалось от числа синцитиев, индуцированных в макрокультуре. Метод сокультивирования используется для выявления инфекционного ВЛКРС. Суть его состоит в сокультивировании лимфоцитов крови и чувствительных клеток монослойной культуры с последующим выявлением АГ ВЛКРС с помощью ТСО, РИД или ИФА.

РДП (РИД). Эго относительно чувствительный тест для выявления гликопротеина ВЛКРС. Позволяет выявлять гликопротеин вируса в концентрации 0,4 мкг/мл.

Биопроба. Инфицированных животных можно выявлять путем постановки биопробы на овцах. С этой целью овцам обычно внутрибрюшинно вводят цельную кровь испытуемого животного. При наличии в пробе крови вируса у овцы развивается инфекция, сопровождающаяся образованием вирусспецифических АТ. АТ у зараженных овец выявляют в РДП с гликопротеиниым АГ через 3-6 нед. (6).

Реакция бласттрансформации. Хронический лимфоидный лейкоз КРС характеризуется слабой реакцией бласттрансформации (РБТЛ). Поэтому у животных, подозрительных по заболеванию лейкозом по показателям лейкоцитов крови, проводят РБТЛ в культуре лимфоцитов крови. Показатель РБТЛ выражает процент трансформировавшихся лимфоцитов (переходные клетки, бласты, митозы) и определяется после подсчета ие менее 1000 клеток культуры. У клинически здоровых и с нормальной гемограммой коров, по данным большинства исследователей, он составляет в среднем 60% (40-90%); у больных лимфолейкозом РБТЛ значительно снижена уже в субклинической стадии. При повышенном содержании в крови общего количества лейкоцитов исследуют животных в РБТЛ. Диагноз иа лимфолей- коз считают подтвержденным при показателе РБТЛ не выше 35%. Если он выше, то постановку реакции повторяют с интервалом 3 мес у тех животных, у которых нарастают гематологические изменения.

Гистологические исследования. Срезы готовят после парафиновой или целллоидино- вой проводки и окрашивают гематоксилин-эозином. При лимфоидном лейкозе наблюдают в селезенке и лимфоузлах стирание рисунка за счет диффузной инфильтрации клеток лимфоидного ряда, среди которых, в основном выявляют зрелые лимфоциты, в меньшем количестве обнаруживают пролимфоциты, лимфобласты. В костном мозге строма сохранена, выявляется значительное истончение и рассасывание балок, скопления лимфоцитов могут располагаться в виде очагов или диффузно, заполняя все костно-мозговые пространства (лимфоидная метаплазия); в почках, печени, сердце, сычуге и других органах обычно выявляют скопления лимфоцитов в просветах капилляров и инфильтрации лимфоидными клетками интерстициальной ткани.

При недифференцированном и слабо дифференцированном лейкозе (гемо-цитоблазтоз) в костном мозге, селезенке, лимфоузлах и других органах наблюдают очаговые и диффузные пролифераты, клеточный состав которых представлен недифференцированными или слабо дифференцированными клетками типа гемоцитобластов (родоначальная клетка). При миелоидном лейкозе (встречается редко) обнаруживают в селезенке незрелые элементы гра- нулоцитарного ряда, мегакариоциты, клетки типа гемоцитобластов, фрагментацию и распад аргирофильных волокон, в костном мозге - скопления зрелых и незрелых клеток гранулоци- тарного ряда; в лимфоузлах, печени, почках, легких и других органах - очаговые диффузные разрастания миелоидных элементов; при лимфосаркоме (слабо дифференцированная лимфобластическая, лимфоцитарная, гистоцитарная) в лимфоузлах, органах пищеварения, воспроизведения, сердечной, скелетных мышцах, других органах и тканях отмечают разрастание опухолей из недифференцированных или слабо дифференцированных клеток лимфоидного типа. Селезенка и костный мозг не изменены.

При лимфогранулематозе выявляют гиперплазию лимфоидных клеток или полиморфноклеточную пролиферацию, склеротические изменения и некрозы в лимфоузлах, селезенке, печени и других органах; среди полиморфных клеток выявляют многоядерные гигантские клетки типа Березовского - Штернберга, плазматические клетки, эозинофилы и нейтрофилы различной зрелости , а также фибробласты. Для установления причин несоответствия прижизненных и посмертных диагнозов на лейкоз патологический процесс при этой болезни был разделен на 5 стадий: скрытая (инкубационная), преддейкозное состояние, начальная, развернутая и конечная. Диагноз по картине крови при гистологическом исследовании не подтверждался лишь на ранних стадиях развития процесса, что не отрицало возможности нарушения лимфопоэза, при котором отмечалась усиленная пролиферация лимфоцитов и наводнение ими периферической крови. Отсутствие малигнизированных, лейкемических лимфоцитов на ранних стадиях болезни подтверждалось не только цитоморфологическими, но и физико-химическими методами исследований. Изучение тонких морфологических особенностей клеточных элементов крови и кроветорных органов позволило разделить все клетки на 4 группы, из которых патогномоничное значение имеют клетки 3-й группы - молодые и малодифференцированные клетки гемопоэза; и клетки 4-ой группы - атипичные, малигнизированные клетки, отражающие опухолевый процесс.

Комплексные методы исследования позволили дифференцировать различные формы гемобластов у КРС. К гемобластозам с системным поражением органов кроветворения отнесены лейкозы: лимфоидный, недифференцированный (гемоцитобластоз), гистиоцитарный (системный ретикулез) и миелоидный. К опухолевым гемобластозам (гематосаркомы) авторы относят: лимфосаркому, гистиоцитарную саркому или лимфогранулематоз (13).

Гематологический метод. Основан на обнаружении в периферической крови повышенного количества лейкоцитов, в основном лимфоидного ряда, и слабодифференцированных клеток (родоначальных, пролимфоцитов, лимфобластов). Количество лейкоцитов подсчитывают с помощью электронного счетчика частиц или в камере Горяева и выводят лейкоцитарную формулу. Животных, подозрительных по заболеванию лейкозом, подтвергают дополнительным гематологическим исследоаниям с интервалом 2-3 мес до получения 2-х подряд качественно одинаковых результатов, по которым их признают здоровыми или больными лейкозом (табл. XI.2)

Следует иметь в виду, что некоторые острые и хронические болезни КРС (перикардиты, ретикулиты, гепатохолангиты, циррроз печени, туберкулез, бруцеллез и др.) могут сопровождаться лейкоцитозом. При этом в отличие от лейкоза увеличение количества лейкоцитов крови происходит, в основном, за счет нейтрофилов, эозинофилов или моноцитов.

Эти изменения крови имеют временный характер, их дифференцируют от лейкоза по-

Таблица XI.2. Число лейкоцитов и лимфоцитов в 1 мм3 крови здорового,

подозрительного по заболеванию и больного лейкозом КРС Возраст животных (лет) Число лейкоцитов у здоровых Абсолютное число лимфоцитов у подозрительных Абсолютное число лимфоцитов у больных От 2 до 4 До 11000 От 8000 до 10000 Свыше 10000 От 4 до 6 До 10000 От 6500 до 9000 Свыше 9000 Старше 6 До 9000 От 5500 до 8000 Свыше 8000

вторньми гематологическими исследованиями. Разработана методика выделения мононук- леарных клеток из периферической крови инфицированного КРС и их культивирования для репродукции инфекционного вируса лейкоза. Метод позволяет получать максимальный сбор инфицированных вирусом лейкоза лимфоцитов. Из 10 мл цельной крови получают примерно 107 мононуклеарных клеток. Чтобы максимизировать продукцию вирионов и вирусных АГ, к культуре лимфоцитов добавляют Кон-А в конечной концентрации 5 мг/мл (22).

Конкурентный радиоиммуноанализ (РИА). Наиболее чувствительный метод выявления р24-АГ в краткосрочных культурах лимфоцитов крови инфицированных животных. Метод заключается в том, что экстракт, приготовленный из 48-ч культуры лимфоцитов крови, исследуется на присутствие АГ р24 путем определения его способности предотвращать связывание меченого изотопом р24 со специфическими АТ. Для диагностики инфекции ВЛКРС у телят младше 6-мес возраста, которым выпаивали молозиво инфицированных матерей, а также у взрослых животных, иммунизированных убитым вирусом или вирусными АГ, необходимо использовать методы, основанные на прямом выявлении инфекционного вируса или вирусных АГ в культурах лимфоцитов крови исследуемых животных.

ПЦР. Дает возможность обнаруживать провирусную ДНК через 2 нед после заражения животных (16). Для амплификации в ПЦР использовали пары праймеров, соответствующих определенным участкам генов gog 24, епу^р5 или ро1 вируса лейкоза. Метод позволяет идентифицировать одну копию генома вируса лейкоза на 100000 клеток крови (23, 24). Сконцентрированные также праймеры для амплификации специфических для вируса лейкоза КРС последовательностей генов ро1 и рХ. С помощью этого набора праймеров удавалось амплифицировать и выявлять 10 копий ДНК вируса в присутствии в образце 1 мкг хромосомной ДНК (30). Доказана возможность использования нерадиоактивных зондов для выявления вируса лейкоза КРС в лимфоцитах периферической крови и клетках лимфосаркомы. Фрагменты провирусной ДНК метят биотином (26). Разработан метод ПЦР с последующей нерадиоактивной блот-гибридизацией для тестирования провируса лейкоза КРС в исследуемом материале (19).

Серологическая идентификация

ИФ. Используют прямой и непрямой варианты при исследовании мазков крови и измененных органов, краткосрочных и перевиваемых культур крови и тканей. Непрямой вариант испытывали на концентрате с 80% живых лейкоцитов. В качестве АТ применяли сыворотку больной лейкозом коровы и меченную ФИТЦ кроличью сыворотку против глобулинов быка. При микроскопии препаратов отмечена флюоресценция на поверхности лимфоцитов в виде яркого светящегося кольца или кольца из пунктиров. В препаратах из лейкоцитов здоровых животных подобного свечения не наблюдается или оно слабо выражено в некоторых клетках. Для объективной оценки препаратов рассчитывается индекс флюоресценции (ИФ) по формуле ИФ = (А - В) : А, где А - процент несветящихся клеток в контроле; В - процент не- светящихся клеток в опыте. Положительной считается реакция, если ИФ свыше 0,2 ; сомнительной - 0,11-0,2; отрицательной - ниже 0,1.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. У животных, зараженных ВЛ КРС, вырабатываются АТ к вирусным АГ, которые выявляются с помощью серологических реакций. Характерной особенностью инфекции ВЛКРС у КРС является, как правило, пожизненная персистенция вируса и вирусспецифических АТ у больного животного. Поэтому серологические методы обнаружения специфических сывороточных АТ являются наиболее практичными, экономичными и широко используемыми в диагностике онковирусной инфекции у КРС. Серологическими методами ВЛКРС можно выявлять у животных старше 6 мес, так как у телят, выпаиваемых молозивом и молоком инфицированных ВЛКРС матерей, появляются пассивно приобретенные материнские АТ, которые могут персистировать до 6- мес возраста. У зараженных животных в крови циркулируют АТ к нескольким структурным белкам вируса. Однако диагностическое значение имеют АТ против gp51 и р24 ВБЛ (37). Количественные соотношения АТ анти-р24 и aHTH-gp51 могут коррелировать со стадией инфекционного процесса (22, 37), но при этом, АТ к gp51 появляются раньше и содержатся в более высоком титре, чем антитела к р24 и, следовательно, серологические реакции, направленные на выявление aHra-gp51 - АТ по со своей чувствительности будут превосходить аналоги, в которых используется в качестве АГ р24 (13,14,38).

В научно-исследовательских лабораториях для обнаружения специфических АТ используются PH, подавления раннего и позднего поликариоцитоза, нейтрализации псевдотипов и радиоиммуноанализ (РИА) (17, 36, 60). Однако, для эпизоотологического обследования, контроля и борьбы с ВБЛ-инфекцией широко применяют РИД и ИФА, для постановки которых выпускаются соответствующие коммерческие диагностические наборы. Все вышеперечисленные методы предназначены для выявления АТ в индивидуальных пробах сыворотки. Для обнаружения АТ в низких титрах, например, в индивидуальных пробах молока или в сывороточных пулах, или в образцах, полученных из молочного танка, требуется высокая чувствительность РИА или ИФА (17, 36, 63). Разработан ряд серологических реакций для диагностики инфекции, таких как РИФ, РСК, РДП в геле, реакция агглютинации латекса (РАЛ), ELISА, РНГА и реакция нейтрализации псевдотипа (РНПТ).

РДП. Благодаря простоте, специфичности и достаточно высокой эффективности эта реакция получила наибольшее применение с гликопротеинным АГ ВЛКРС. Из вируса, осажденного методом ультрацентрифугирования культуральной жидкости краткосрочных культур лейкоцитов лейкозных животных, очищенного в градиенте плотности сахарозы и обработанного эфиром, получают АГ, который используют в РДП.

Специфические ПА к ВЛКРС появляются через 2 мес после инфицирования и сохраняются пожизненно. Для постановки РДП используют диагностический набор, в состав которого обязательно должны входить специфический АГ ВЛКРС, специфическая положительная сыворотка крови КРС. Реакцию ставят макро- и микрометодами. Для изготовления АГ используют клеточную линию FLK-BLV. Из культуральной жидкости вирусный АГ выделяют методом преципитации сульфатом аммония или полиэтиленгликолем. Но наиболее технологичным методом выделения вирусного АГ считают ультрафильтрацию на полупроницаемых мембранах. На результат реакции иммунодиффузии влияют многие факторы: качество АГ и контрольных сывороток, количественные соотношения АГ и АТ, качество ага- pa, pH и ионная сила буфера, температура, диаметр лунок и расстояние между ними. Для постановки РИД выпускают диагностические наборы: Государственная Курская биофабрика (Россия); PITMAN-MOORE INC., Вашингтон (США), BEHRINGWERKE AG., Марбург (ФРГ), MERIEUX6 Лион (Франция), BIO-VETA NITRAA (Словакия) и др.

Перечисленные диагностикумы представляют собой наборы, состоящие из 2-8 препаратов. Обязательными компонентами каждого набора являются препараты тест-системы: вирусный АГ и антисыворотка, которые в результате специфического взаимодействия АГ (gp51 ВБЛ) и АТ в процессе диффузии формируют в геле агара нерастворимый комплекс в виде опалесцирующей полосы. Дополнительно наборы могут комплектоваться сухой солевой смесью агара, стерильным разбавителем для вирусного АГ и контрольными сыворотками, которые поставляются в жидком или лиофилизированном виде. В последнем случае наборы комплектуют соответствующими разбавителями контрольных сывороток. Наборы рассчитаны на 90-500 исследований и содержат 3-5 мл вирусного АГ.

РИД проходит в 0,8-1,0% геле агара, который готовят на трис-HCl или боратном буферах в диапазоне pH 7,2-8,6, содержащим 8-8,5% NaCl. Методика постановки реакции одинаковая для всех диагностикумов и предусматривает заполнение лунок АГ, антисывороткой и испытуемыми сыворотками по схеме 1:2:4 или 1:3:3. Принято 2 стандарта на диаметр лунок и расстояние между ними: 1 вариант в странах ЕЭС, тогда как в США, Канаде и странах СНГ приняты параметры, соответствующие второму варианту (табл Х1.3,),

Таблица XI.3. Параметры лунок, рекомендуемые для постановки РИД Показатели 1 вар 2 вар Диаметр центральной лунки для антигена мм 4 7 Диаметр периферических лунок для сыворотки мм 6 7 Расстояние между центральной и периферической лунками мм 3 3

Минимальные необходимые требования, которым должен удовлетворять диагностический набор, заключаются в следующем: АГ должен содержать оболочечный гликопротеин ВБЛ, стандартизованный по референтной сыворотке Е-1; референтная сыворотка Е-4, разведенная отрицательной сывороткой в соотношении 1:10, должна быть выявлена как положительная без повторной постановки реакции или предварительной концентрации. Референтные сыворотки Е-1 и Е-4 изготовлены в Национальной ветеринарной лаборатории Дании (P.O. Box 373, DK-1503 Copengagen) и предназначены для стандартизации всех диагностических наборов для постановки РИД и ИФА (6).

Реакцию учитывают через 48 ч и при следующих показаниях контролей: наличие четкой контрольной полосы преципитации между АГ и специфической положительной сывороткой и отсутствие таковой с отрицательной контрольной сывороткой. Животных, сыворотки крови которых положительно прореагировали в РДП, считают зараженными ВЛКРС.

Описаны модификация метода иммунодиффузии - усиленная танином непрямая двойная иммунодифузия в геле (НИД-Р) и её применение для выявления АТ и АГ ВЛКРС (31). Современная диагностика энзоотического лейкоза КРС основана большей частью на тестах иммунодифузии и ELISA. При использовании РИД необходимо придерживаться рекомендаций производителя очень дорогого АГ. В целях снижения затрат при сохранении надежности результатов югославские исследователи (19) уменьшили размер отверстий в розетке и слой агара в чашке Петри, сохраняя прежнюю чувствительность теста.

Предложен метод очистки вируса лейкоза КРС в градиенте плотности перколла. Метод рекомендован для получения очищенного вируса и специфического АГ (20, 21). Молдавскими исследователями показано значительное преимущество РИД при исследовании моло зива: титр АТ был в 8-32 раза выше, чем в пробах сыворотки крови; исследовать необходимо первые порции молозива (29). Аналогичные данные получены сотрудниками ВИЭВ. Титр AT Kgp51 и р24 BJI КРС сразу после отела был наивысшим - 1:2187-1:59049 в ИФА и 1:16-1:512 в РДП. Через 1 сут титр АТ составлял 25% от исходного (10).

РАЛ. В качестве теста для прижизненной диагностики лейкоза КРС можно использовать иммунохимическую реакцию агглютинации с латексом в соответствии с временными методическими рекомендациями. Животные, сыворотки крови которых дали положительную реакцию агглютинации с латексом, подлежат тщательному обследованию на лейкоз другими методами. Данная реакция перспективна для прижизненной диагностики лейкозов. Испытание этой реакции показало в 67% случаев совпадение результатов с гематологическими и около 90% с гистологическими методами диагностики гемобластозов КРС.

ИФ. Менее широко применяют для обнаружения АТ в сыворотках крови инфицированных животных. При этом используют в качестве клеток-мишеней перевиваемые культуры, хронически инфицированные ВЛКРС.

РНГА. Является чувствительным методом обнаружения АТ в сыворотке крови и молоке. Рекомендуют использовать при экспертизе и санитарной оценке молока. Наибольший процент совпадений гематологических показателей с результатами серологических исследований был отмечен в РНГ А.

ELISA. Широко применяют в США, Бельгии с использованием монАТ для широкомасштабного выявления энзоотического лейкоза в стадах КРС. Чувствительность его выше, чем РДП. Метод ELISA при диагностике лейкоза КРС может существенно повысить чувствительность серодиагностики по сравнению с РДП. Он удобен для систематического контроля молока коров благополучных хозяйств.

ELISA с монАТ ставят с пулом сывороток крови, объединенных от животных одного стада. Предложено выявлять инфицированность ВЛКРС по наличию АТ в молозиве коров ELISA. Все образцы молока, взятые от больных коров, позитивных по АТ к вирусу в сыворотках, оказались положительными. Во ВНИИВиМ получены 6 гибридом, секретирующих монАТ к ВЛКРС. На основе монАТ к gp51 предложен “сэндвич” вариант ИФА для выявления вирусного АГ. Установлено, что структура и доступность антигенных детерминант варьирует в разных системах титрования. Внесение радиоактивной метки может изменять конфигурацию АГ сайтов, что сказывается на результатах исследования сывороток. Анти ВЛ КРС АТ конкурировали со специфическим пероксидазным конъюгатом на основе монАТ за связывание с gp51 (28а).

Первым этапом в постановке “классического “ варианта ИФА для выявления АТ против ВЛКРС является непосредственное покрытие лунок микропанелей вирусным АГ. При этом получают большой процент ложноположительных результатов из-за неспецифического взаимодействия невирусных компонентов АГ с испытуемыми сыворотками. Более того, использование очищенных вирусных белков в качестве АГ экономически неоправданно и не позволяет получать стандартный препарат, что сказывается на воспроизводимости результатов ИФА. Поэтому в настоящее время почти все наборы для постановки ИФА изготавливаются с использованием захвата АГ АТ, сорбированными на стенки лунок микропанелей. Существующие варианты ИФА включают 5 принципиальных этапов постановки реакции.

Этап I. Реагенты для захвата АГ: а).монАТ против gp51; б).монАТ против р24;

в).Поликлональные AT (gp51+p24) КРС. Этап 2. Антиген: а) надосадочная жидкость после культивирования клеток FLK-BLV; б) культуральная жидкость, содержащая продукты генов env или gag ВЛКРС, экспрессируемые рекомбинантными векторами. Этап 3. Испытуемые сыворотки. Этап 4. Реагенты для обнаружения иммунного комплекса.

Непрямые варианты ИФА: монАТ против бычьего IgG; полиАТ против бычьего IgG.

Конкурентный или блокирующий варианты ИФА: а) монАТ против gp51 (направленные против других эпитопов нежели использованных на этапе 1а); б) Бычьи поликлональные АТ (такие, как на этапе 1в)

Этап 5. Цветная индикация. Реагенты для индикации иммунного комплекса (этап 4) можно метить биотином или ферментами, чаще используют пероксидазу хрена. При постановке ИФА каждая микропанель должна содержать лунки, заполненные положительной и отрицательной контрольными сыворотками.

ИФА позволяет выявлять АТ в титрах в 10-100 раз меньших, чем обнаруживает РИД. Все коммерческие наборы ИФА должны быть стандартизированы по референтной сыворотке Е-4. Причем, процедура стандартизации предусматривает 3 возможных варианта использования наборов ИФА для исследования: 1) индивидуальных проб сыворотки; 2) индивидуальных проб молока; 3) пулов сыворотки и молока.

Поскольку в молоке АТ к ВЛКРС в 25 раз больше, чем в сыворотке крови, модифицированный ELISA должен обладать высокой чувствительностью (18). При диагностике лейкоза КРС качество используемых диагностикумов имеет первостепенное значение. Наиболее пригодным для ИФА в качестве АГ являются препараты вируса, полученные 2-кратным высокоскоростным центрифугированием и синтетический пептид. В Швеции разработан ELISA для исследования молока и сывороток крови. В Бельгии рекомендован конкурентный ELIS А с использованием монАТ и меченного пероксидазой конъюгата aHm-gp51 (27). МонАТ Д9 и F11 против лимфоцитов больных лейкозом животных связываются с АГ лимфоцитов крови больного КРС, «не распознают» АГ, ассоциированные с лейкозом (3). ELISA с использованием монАТ, превосходит непрямой тест ELISA (17).

Параллельно с ИФА АТ, определяли РИД и электрофореза в полиакриламидном геле. Чувствительность ИФА, испытанного в 5 лабораториях Германии, составляла в среднем 97,6%, что в 4 раза выше РИД. Специфичность ИФА равнялась в среднем 98,1 % (25). При использовании АГ из культуральных жидкостей клеток почки эмбриона ягнят, персистентно инфицированных ВЛКРС в положительных сыворотках с помощью иммуноблотинга, обнаруживали АТ к р24, р15, р12, plO, gp30, и gp51. В иммуноблотинге оказались активными монАТ к р24 и gp51. Данный метод оказался более чувствительным, чем иммунодиффузия в агаровом геле и ИФА (15). В ИФА возможно использование синтетических пептидов - фрагментов структурного гликопротеина gp51, синтезированных во ВНИИЗЖ (36).

Аллергическая реакция. Разработан аллерген для диагностики лейкоза у животных. Для проведения аллергических реакций наиболее подходящее место хвостовая складка у овец и КРС и дорсальная поверхность уха у свиней.

Дифференциальный диагноз. Лейкоз необходимо отличать от актиномикоза, туберкулеза, паратуберкулеза и бруцеллеза. При актиномикозе поражаются, главным образом, лимфоузлы головы и грудной области (подчелюстные, заглоточные, околоушные и др.). Они плотной консистенции, с инкапсулированными абсцессами. В центре актиномикозного узла (гранулемы) гистологически обнаруживают друзы гриба. При туберкулезе чаще поражения в виде узелков, имеющих специфическое гистологическое строение, находятся в легких, кишечнике. Для паратуберкулеза характерно наличие изменений в кишечнике и брыжеечных лимфоузлах. В кишечнике развиваются продуктивное воспаление и очаговые инфильтраты из эпителиоидных клеток, в результате чего стенка утолщается в 5 и более раз. В лимфоузлах отмечают обширные скопления из эпителиоидных элементов с наличием среди них гистиоцитов и клеток типа Лангерганса. Специфическим методом окраски выявляют бактерии паратуберкулеза, локализующиеся в эпителиоидных и гигантских клетках. Бруцеллез диагностируют с помощью РСК, РА и аллергической пробы.

ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА Проблема специфической профилактики лейкоза КРС ие решена, хотя исследования в этой области продолжаются и по сегодняшний день. Против лейкоза КРС получена рекомбинантная вирусвакцина, содержащая генетическую информацию, кодирующую gp51 и gp30 поверхностного АГ (28). Также показана возможность вакцинации КРС против лейкоза гетерологичными клетками млекопитающих, способными продуцировать оболочечные АГ ВЛКРС и его внутренний белок р24. Так, штамм клеток овец NP-2 способен продуцировать продукты гена env и вызывать АТ образование против этих белков в организме крыс и КРС. Вакцина из клеток NP-2 защищала бычков от естественного инфицирования ВЛ (10).

Опубликованы результаты исследований по получению и использованию рекомбинантных вирусов осповакцины, включающих либо полный ген белка оболочки (env), либо только фрагмент гена env с последовательностью, кодирующей гликопротеин gp51 env и часть gp30 ВЛКРС. Вакцинация овец рекомбинантными BLV-вакцинами, содержащими полный ген env, защищает овец от инфекции ВЛКРС, свидетельством чего служит отсутствие перси- стенции высоких титров aHTH-gp51-AT по сравнению с невакцинированными В Л инфицированными животными, ярковыраженная пролиферативная реакция клеток СД-4 вакцинированных овец на специфические синтетические пептиды gp51 ВЛКРС и отсутствие провируса ВЛКРС у вакцинированных животных спустя 4 мес после заражения диким вирусом. У не- вакцинированных овец с помощью ПЦР вирус обнаруживался в течение 16 мес наблюдения. Высказывается предположение о существенной роли клеточных иммунных реакций в развитии защитного иммунитета против ВЛКРС. Наличие протяженных высококонсервативных аминокислотных последоватльностей в генах env и pol, в вирусных изолятах из разных стран вселяет надежду на получение вакцин на основе пептидов (64). Препарат, содержащий gp51 р24, вызывает устойчивость КРС к заражению вирусом лейкоза.

Оценивали перспективность для КРС 2-х вакцин, приготовленных из вирусного материала, полученного на клетках LK-15 и клетках легкого летучей мыши. Материал инактивировали 0,1%-иым тритоном XI00 или 0,1%-ным формальдегидом. Животных вакцинировали дважды с 2-нед интервалом и заражали через 4 нед после последней вакцинации. Животные, у которых после вакцинации обнаруживались АТ в РДП к вирусным гликопротеинам в титрах выше 1:16, оказались устойчивыми к заражению 100 мл крови коровы, персистентно инфицированной вирусом ВЛКРС. Повышение инфицирующей дозы до 500 мл понижало протективный эффект (63).

Для изготовления вакцины использовали стабильную линию клеток FLK, персистентно инфицированную ВЛКРС. Материал инактивировали формальдегидом или глютаральдеги- дом и добавляли адъювант. Только препарат, инактивированный формальдегидом, обладал протективным действием. Вирус, инактивированный 0,05%-ным АЭИ или 0,02%-ным ДЭИ в течение 8 ч при 37°С, сохранял активность вирусного оболочечного гликопротеина и терял инфекционность (синтициеобразующую способность). При проверке АГ препаратов, приготовленных из ВЛКРС, наиболее активным был препарат «ОВБ», который у привитых телят индуцировал образование АТ к гликопротеиновому и внутреннему АГ вируса (47).

В РФ созданы конструкции на основе вируса осповакцины (ВОВ), несущие ген env ВЛКРС (5, 42). Основная цель этой работы - создание живой рекомбинантной вакцины против ВЛКРС (2). В лабораторных условиях отобраны штаммы, обладающие наиболее выраженными АГ - и иммуногенными свойствами. Рекомбинатный белок, полученный в результате культивирования поксвирусного вектора в культуре клеток, иммунологически идентичен gp51 ВЛКРС (4).

Для изготовления вакцины против ВЛ КРС использовали рекомбинантный ВОВ на основе UIT.WR, содержащего экспрессирующие нуклеотидные последовательсноти gp51-gp30 ВЛКРС. На протяжении 3 лет вакцину испытывали в производственных условиях в хозяйстве с уровнем инфицированное™ 30-40%. В результате установлено, что относительное число сероположительных животных из числа вакцинированных за время наблюдения не увеличивается, тогда как среди невакцинированных оно постоянно возрастает. Более того, все серопозитивные животные из вакцинированной группы имели нормальные гематологические показатели, тогда как у контрольных обнаружены изменения крови, характерные для гемобластозов (9а, 118). Продолжаются испытания в полевых условиях вакцинного препарата, полученного на основе одного из рекомбинатных штаммов (1). Разные штаммы ВОВ на основе вектора WR вызывали образование aHTH-gp51 или после первичной иммунизации, или только после ревакцинации. Рекомбинатный ВОВ шт. WR-BLV-4KTk+ реизолирован только из образцов кожи, взятых с места введения на 3-16-й день. Вирус не выделялся из плазмы крови, тканевых гомогенатов сердца, легких, почек, печени, селезенки, лимфоузлов, головного мозга, скелетных мышц, яичников, что свидетельствует о его безопасности (26). С обнадеживающим результатом испытывается и инактивированная вакцина против ВЛКРС (23). По-видимому, в профилактике и борьбе с лейкозом КРС найдут применение различные методы коррекции иммунологической недостаточности, проявляющейся синтезом АТ с низким авидитетом (10,11).