Новые методы и средства исследования

В XIX в. в основном изучали мертвую клетку после ее фиксации и окраски. При этом удавалось описать ряд ее органоидов и структур — митохондрии, аппарат Гольджи, клеточный центр и т.

Это очень отчетливо проявилось, например, во время спора, возникшего в конце XIX

в., о тонкой структуре цитоплазмы, когда были предложены различные теории строения протоплазмы — зернистого (Р. Альтман), фибриллярного (В. Флемминг) и пенистого, или ячеистого (О. Бючли). А. Фишер (1899) обнаружил беспредметность этого спора. На белковых моделях он показал, что в зависимости от условий опыта возможно получение картин, соответствующих всем трем теориям строения цитоплазмы.

Возникла необходимость, не отказываясь от этого пути исследования, совмещать его с наблюдением живой клетки. Систематическое изучение живых клеток началось только в начале XX в. благодаря открытию возможности переживания клеток в культуре вне организма.

Метод эксплантации был впервые применен американцем Р. Гаррисоном в 1907 г. На кусочках зачатка нервной системы лягушки, помещенных в каплю лимфы, он наблюдал переживание клеток в течение некоторого времени и даже появление и рост у них нервных отростков. Метод культуры ткани был затем значительно усовершенствован в работах А. Карреля (1911—1915), М. Берроуса (1910, 1912), А. А. Максимова (1916, 1925), В. и М. Льюисов (1911 и позднее), А. Фишера (1925), А. В. Румянцева (1932) и многих других.

Широкое и полноценное использование культивируемых вне организма клеток для цитологических исследований стало возможным благодаря

введению в 50-х годах метода клеточных культур на жидких питательных средах.

Клеточные культуры представляют собой популяции самостоятельных клеток, которые только вторично и далеко не всегда устанавливают между собой протоплазматические связи, однако оказывают взаимное гуморальное влияние.

Наряду с применением клеточных культур в цитологии, особенно в последние годы, широко используются культуры органов, клетки которых входят в состав целых эмбриональных зачатков или фрагментов органов взрослых животных (А. Тома, 1970).

Существенное значение для развития метода прижизненного изучения клетки имело усовершенствование оптических средств исследования. К их числу относится прежде всего темнопольная микроскопия («ультрамикроскопия»), практическое применение которой стало возможно после изобретения в 1910 г. Г. Зидентопфом кардиоид-конденсора. Важные цитологические наблюдения с использованием темнопольной методики сделал Н. М. Гайдуков (1916).

В 40—50-х годах широкое распространение получила фазово-контраст- ная микроскопия. Ее разновидностью явилось аноптральное устройство, схему которого разработали А. Вильска (1953) и М. А. Пешков.

Прижизненному изучению клетки содействовало также развитие люминесцентной (флуоресцентной) микроскопии. В основе этого метода лежит открытие А. Келером (1904) флуоресценции объектов в темном поле

при освещении их ультрафиолетовыми лучами (УФ). Широкое применение в цитологии люминесцентного микроскопа, сконструированного Келером и Зидентопфом (1908), стало возможным после того, как М. Гай- тингер разработал метод окраски биологических объектов флуорохрома- ми — веществами, обладающими способностью светиться после их УФ- облучения. С помощью люминесцентной микроскопии получены ценные сведения о строении, обмене веществ и функционировании нормальных и патологически измененных клеток (раковых, после воздействия вирусов и т. д.).

Одно из наиболее важных направлений флуоресцентной микроскопии связано с применением метода флуоресцирующих антител, впервые предложенного в 1941—1942 гг.

Основным методом изучения клетки в прижизненном состоянии стала микрургия, дающая возможность производить на клетках разнообразные операции. Разработка достаточно совершенной техники операций на клетках относится к началу XX в., когда был сконструирован микроманипулятор. Этот инструмент позволил извлекать из клетки отдельные органоиды (в частности, хромосомы), измерять электрические потенциалы с помощью микроэлектродов, вводить в клетку разнообразные вещества, бактерии, ядра и другие компоненты сходных или чужеродных клеток. Микроманипулятор был создан в самом начале XX в. одновременно С. Схоутеном (1901) в Нидерландах, М. Мак-Клендоном и М. Барбером (1901) в США. С. С. Чахотин (1959) использовал изобретенный им микрооператор (1912) для строго локализованного воздействия на клетку пучка УФ (лучевой микроукол). С помощью локального воздействия УФ удавалось нарушить двойное лучепреломление в ахроматическом веретене (клетки подсолнечника), повредить участки митотического аппарата (в клетках тритона) и т. д. Основные работы с микроманипулятором были выполнены во втором десятилетии XX в. американским исследователем Р. Чемберсом.

Наряду со значительными успехами в изучении живой клетки XX в. ознаменовался крупными достижениями и в исследовании клетки фиксированной. Первостепенную роль здесь сыграли методы цитохимии (гистохимии) .

Основной задачей цитохимии является выяснение химической природы клеточных структур и продуктов жизнедеятельности клетки, а также РОБЕРТ ЧЕМБЕРС (1881-1957)

«як

расшифровка происходящих в ней биохимических процессов. Цитохимические методы исследования дают возможность топографически изучить локализацию ряда химических веществ и процессов. Применение всех цитохимических реакций основано на природной или искусственно создаваемой окраске изучаемых веществ. Примером цитохимических реакций первого рода является изучение пигментов в клетке, а применение реакций второго рода основано на избирательной окраске некоторых внутриклеточных веществ (например, окраска нейтрального жира Суданом) или на выпадении в результате химической реакции нерастворимого осадка какого-либо вещества. Так, о наличии и локализации активности кислой фосфатазы судят по локализации осадка сернистого свинца в присутствии субстрата ферментативной реакции ([5-глицерофосфата) .

Гистохимия и цитохимия берут свое начало от исследований француза Ф. Распайля, выполненных еще в 30-х годах XIX в. Он, по-видимому, первым использовал йодную реакцию на крахмал для его обнаружения в растительной клетке. Интенсивное развитие цитохимии началось в 30—40-х годах XX в., когда были предложены методы обнаружения важнейших химических компонентов клетки и опубликован ряд соответствующих руководств и статей. Основополагающее значение имели труды JI. Лизона (1936, 1953), а также работы К. Бенсли (1941), Д. Гли- ка (1950), Дж. Гомори (1952), Э. Пирса (1962) и многих других. Современные цитохимические методы дают возможность изучать биохимические процессы не только в неразрушенной, но иногда и в живой клетке. С помощью этих методов оказывается возможным связать изучаемый биохимический процесс с определенной клеточной структурой и прослеживать его в динамике. Одной из важнейших цитохимических реакций, введенных в первой половине XX в., является открытая Р. Фельгеном (1924) специфическая реакция на ДНК.

Наряду с цитохимическими методами использовалось также дифференциальное центрифугирование, дающее возможность изолировать из клетки и разделить входящие в ее состав органоиды. Впервые дифференциальное центрифугирование было применено в 30-х годах К. Бенс- ли и Н. Херром для выделения и обособленного анализа митохондрий.

Существенную роль в изучении обмена веществ клетки сыграл введенный в 1940 г. шведским ученым Т. Касперсоном метод количественного учета веществ (главным образом нуклеиновых кислот) по поглощению в изучаемом объекте УФ-лучей определенной длины волны. Этот точный метод дает возможность получить сведения о количестве и распределении нуклеиновых компонентов клетки и некоторых других звеньев ее метаболизма.

При изучении динамики обмена веществ клетки большое распространение получило использование радиоактивных изотопов и радиоавтографии (Г. Хевеши, 1950; Дж. Бойд, 1957). Оно основано на том, что радиоактивные изотопы (3Н, 14С, 36S, 15N), подведенные к клеткам в процессе метаболизма, включаются в состав некоторых важных химических компонентов (ДНК, РНК и белков). Если покрыть гистологический срез или пластинку, на которой растет однослойная клеточная культура, жидкой фотоэмульсией, то вещества, излучающие главным образом ^-части- цы, вызовут восстановление бромистого серебра. По выявившимся зернам металлического серебра можно получить представление о локализации и количестве изучаемого вещества (Л. Н. Жинкин, 1959). Оказалось, что использование радиоактивных изотопов дает возможность изучить динамику синтеза ДНК (М. Говард, С. Пелк, 1951). Особенно большое значение для цитологии радиоавтография приобрела после того, как в 1959 г. Г. Квастлером и Ф. Шерманом был разработан метод радиоавтотрафии с использованием предшественника ДНК — 3Н-тимидина.

Наконец, очень важным методическим приемом, коренным образом изменившим направление цитологии, явилась электронная микроскопия. Проектирование и создание электронного микроскопа относятся к 30-м годам и связано с именами преимущественно немецких физиков (Ф. Вольф, М. Кнолль, Э. Руска, Э. Брюхе, Г. Иохансон). Этот метод в сочетании с использованием ультратонких срезов позволяет изучить ультрамикроскопическую структуру всех основных органоидов (современные электронные микроскопы обладают разрешающей способностью в несколько микронов). Применение электронного микроскопа привело к перестройке классических представлений не только о строении клетки, но и о ходе многих процессов ее жизнедеятельности.

Наибольшие результаты дает сочетание высокой техники электронномикроскопического исследования с комбинированным применением радио- автографических и цитохимических методов. Используя связывание тяжелых металлов (свинца, кадмия) определенными компонентами клетки, можно выяснить ультрамикроскопическую локализацию ферментативной активности (сукцинатдегидрогеназной, фосфатазной и т. д.) Точно так же, определив на ультратонких срезах место локализации металлического се ребра после предварительного введения радиоизотопов, можно получить данные об участках метаболической активности клетки.

В настоящее время в области ультраструктуры клетки после работ

А. Клода (1940), Г. Палада (1952, 1953), Ф. Шёстранда (1956), К. Портера (1961) и других достаточно отчетливо выяснены как общая схема строения клетки, так и организация ее отдельных структурных элементов.

Сравнительно недавно были обнаружены, опксаны и идентифицированы эндоплазматическая сеть, мембранная система, лизосомы, фаго- сомы, микротельца, микротрубочки и другие структуры. Ядро, ядрышко, митохондрии, комплекс Го ль джи, клеточный центр, плазматическая и ядерная оболочки, известные ранее, описаны при помощи новых методических приемов во всех ультраструктурних деталях. С помощью электронной микроскопии удалось выяснить морфологический субстрат основных процессов, происходящих в клетке,— пассивного и активного проникновения в нее различных веществ, слияния и рекомбинации мембран, выделения секретов, фагоцитоза и пиноцитоза, движения и сократимости, проведения нервных импульсов (см. главу 11).

Таким образом, развитие техники цитологических исследований и введение некоторых принципиально новых методических приемов одновременно послужило предпосылкой развития цитологии и предопределило формирование основных направлений, по которым пошло ее дальнейшее развитие.