Лабораторная работа №31. СПЕРМАТОЗОИДЫ КОСТИСТЫХ РЫБ КАК ТЕСТ-ОБЪЕКТ В ЭКОЛОГО-ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИХИССЛЕДОВАНИЯХ {Методика разработана Ю. К. Дорониным)

  Сперматозоиды позвоночных, в частности сперматозоиды костистых рыб, отличаются чрезвычайно важной особенностью: они транскрипционно пассивны. Иными словами, реакция на внешнее воздействие не может опосредоваться активацией или блоком транскрипции тех или иных генов, но обеспечена непосредственными изменениями структуры и функциональных проявлений органелл. Структура сперматозоидов «вырождена»: протоплазма- тическая мембрана ограничивает чрезвычайно малый объем, большую часть которого занимает гиперконденсированный хроматин ядра («головка» сперматозоида), протяженную, типичную для эука- риотных клеток, двигательную систему («хвост») и систему митохондрий, расположенную в основании хвоста. Помимо этих структур в составе сперматозоидов многих видов позвоночных (но не у костистых рыб) присутствует акросома — модифицированный аппарат Гольджи, деятельность которого обеспечивает проникновение ядра сперматозоида в яйцо.
В лабораторной работе приведены основные экспериментальные приемы объективной регистрации состояния перечисленных органелл и двигательной активности целых сперматозоидов широко используемой в качестве объекта исследований костистой рыбы — вьюна, Misgurnus fossilis L.
Принцип оценки жизнеспособности сперматозоидов по двигательной активности состоит в активации сперматозоидов в гипотонической среде и регистрации их подвижности с помощью цифровой камеры или на фотопленке.
Принцип метода определения состояния мембран сперматозоидов состоит в том, что интактная плазмалемма эукариотных клеток и сперматозоидов, в частности, непроницаема для люминесцентного красителя йодистого пропидия. При изменении проницаемости мембраны под влиянием токсичных факторов среды обитания гидробибнтов йодистый пропидий входит в клетку и специ

фически связывается с ДНК. В результате при воздействии возбуждающего освещения ядра клеток приобретают характерное красное свечение.
Принцип определения деятельности митохондрий основан на характерном свечении при действии возбуждающего света, связывающегося с митохондриями родамина 123, что свидетельствует об их нормальном функционировании.
Цель работы — оценить изменение подвижности сперматозоидов, состояние их мембран и митохондрий в среде с токсикантами.
Острый цитотоксический эффект определяется по изменениям функциональных показателей сперматозоидов после их активации раствором токсиканта на дистиллированной воде. Хронический цитотоксический эффект также определяется по изменениям функциональных показателей клеток, инкубировавшихся в растворе Рйнгера, приготовленном на растворе тестируемого токсиканта.
Внимание! Во избежание преждевременной активации движения сперматозоидов инкубационная среда должна быть изото- нична.
Биотестирование возможно также проводить на уровне целого организма. Кратковременное биотестирование (до 96 ч) позволит определить острое токсическое действие воды на выбранные показатели физиологического состояния мужской репродуктивной системы рыб. Длительное биотестирование (до 30 сут) позволит определить хроническое токсическое действие воды.
Оборудование, материалы и реактивы:
холодильный шкаф; термостат; камера Горяева; пластиковые пробирки на 1мл; фильтровальная бумага; автоматические микропипетки (дозаторы) с минимальным объемом 5 мкл; микроскопы световой и люминесцентный; цифровая фотокамера; обезжиренные предметные и покровные стекла; 2 аквариума по 10 л для содержания вьюнов (около 30 рыб при температуре 6 — 8 °С); стеклянные сосуды (около 1,5 — 2 л) для экспонирования рыб {2—Ъ особи) в растворе токсиканта; изотонический раствор Рйнгера для холоднокровных организмов (NaCl — 0,65 %, КС1 — 0,025 %, NaHC03 — 0,20 %, CaCl2 — 0,03 %); красители йодистый пропи- дий и родамин 123 в концентрации 10 мкг/мл, приготовленные на растворе Рйнгера; токсикант.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ В один из аквариумов с тест-объектами внести токсикант в исследуемой концентрации (см. табл. 14.1). Другой аквариум с рыбами использовать для содержания контрольных рыб. По истечении времени инкубации для приготовления суспензии сперматозоидов рыб декапитировать. Парные семенники выглядят как светлые полоски, прилегающие к дорсальной поверхности брюшной полости. От ближайшей к выводному протоку части семенника отделить небольшой участок и измельчить его в 10 мл раствора Рингера. Плотность полученной суспензии определить с помощью камеры Горяева (см. лабораторную работу №25) и развести раствором Рингера до окончательной концентрации: обычно это 107 клеток в 1 мл.
Внимание! Образцы сперматозоидов одного организма можно получать неоднократно. Для этого тушку рыбы, завернутую в фильтровальную бумагу, сохраняют в холодильнике при температуре 5 °С. Образцы суспензий сперматозоидов (1 — 0,5 мл) сохраняют в пластиковых пробирках в холодильнике при 5 °С либо термостати- руют при температуре в пределах от 10 до 25 °С. Сперматозоиды вьюна представляют собой мелкие клетки с размером головки 2 мкм и тонким и коротким хвостом длиной 30—40 мкм. В растворе Рингера неподвижны. В гипотонической среде, т.е. при разбавлении раствора Рингера в 2—3 раза, движение сперматозоидов активируется.
Для активизации сперматозоидов 5 мкл суспензии, полученной от одной из рыб, поместить на предметное стекло между двумя покровными стеклами. К капле суспензии добавить 5 мкл дистиллированной воды и быстро накрыть третьим покровным стеклом, опирающимся на первые два, между которыми располагается капля. Препарат немедленно поместить на столик микроскопа и фотографировать с помощью цифровой камеры в темном поле с экспозицией в несколько секунд (например, 4 с) через определенные промежутки времени (например, каждые 15 с) на протяжении всего времени движения сперматозоидов (1 — 2,5 мин).
На полученных изображениях неподвижные сперматозоиды выглядят как яркие точки, в то время как движущиеся клетки оставляют отчетливый светлый след — трек движения (рис. 31.1). На фотографии определить долю движущихся и неподвижных сперматозоидов и измерить длины треков сперматозоидов с помощью многочисленных программ анализа изображений, например «Scionlmage», «ImageJ», «Plana». Проделать аналогичные пп.5 —7 операции со всеми тестируемыми и контрольными рыбами.

Результат тестирования двигательной активности сперматозоидов можно представить так, как изображено на рис. 31.2. По оси X отложены градации скоростей движения сперматозоидов, по оси Y— время получения фотографии, т.е. время, прошедшее с момента активации, а по оси Z — относительная численность движущихся (т. е. активировавшихся) сперматозоидов.

Рис. 31.1. Пример регистрации двигательной активности сперматозоидов
вьюна в суспензии.
Негатив фотографии изображения в темном поле, полученной с помощью цифровой камеры CoolPix 4500 (Nikon, Япония), снабженной специальной универсальной микроскопической насадкой (разработка фирмы «ЛабМетод», Россия). Темные частицы — неподвижные сперматозоиды. Движущиеся сперматозоиды образуют характерные треки (объектив х 6,3; фотоокуляр х 4)


Внимание! Гистограммы, на которых представлены изменения скоростей движения сперматозоидов в последовательные моменты после активации, большей частью представляют собой многовершинные распределения с выраженным эксцессом и асимметрией (см. рис. 31.2). В связи с этим сравнение распределений, характеризующих двигательную активность сперматозоидов и их параметров в подопытной и контрольной группах, а также отражающих изменение центральных тенденций и широту варьирования признака, следует производить с помощью методов непараметрической статистики. В первом случае применяются критерии Пирсона (х2) или Колмогорова—Смирнова, во втором — критерий Вилкоксона или Ансари—Бредли. Средние величины не могут быть параметрами этих распределений, но пригодны для характеристики общей тенденции изменений движения сперматозоидов в результате воздействия тех или иных веществ. Для определения состояния мембраны сперматозоидов к 5 мкл суспензии, помещенной на предметное стекло между двумя покровными стеклами, добавить 5 мкл раствора йодистого про- пидия, приготовленного на растворе Рингера (10 мкг/мл), и накрыть третьим покровным стеклом. Препарат немедленно поместить под объектив люминесцентного микроскопа и фотографировать 5 неперекрывающихся областей в видимом свете и свете, возбуждающем специфическое свечение (максимум возбуждения — 535 нм, максимум эмиссии — 617 нм).



Б
Рис. 31.2. Графическая (А) и табличная (Б) формы данных, полученных
в результате обработки цифровых микрофотографий с изображениями
треков движущихся сперматозоидов, инкубировавшихся при 18 °С.
Ось X — градации скорости движения сперматозоидов, мкм/с; ось Y— моменты
последовательных фотографий активированных сперматозоидов (с); за 0 при-
нят момент активации. Ось Z — число движущихся сперматозоидов, %
На компьютере совместить два изображения одной и той же области и подсчитать долю элементов (целых сперматозоидов и отдельных ядер), меченных йодистым пропидием. Произвести операции, аналогичные описанным в пп. 10 — 12, с суспензиями сперматозоидов, полученных от подвергнутых действию токсиканта рыб или с неактивированными сперматозоидами, инкубировавшимися в растворе токсиканта.
Для определения острого цитотоксического эффекта к 5 мкл суспензии сперматозоидов добавить 5 мкл раствора токсиканта и далее 10 мкл раствора йодистого пропидия.

Рис. 31.3. Динамика убыли доли неметящихся йодистым пропидием ядер сперматозоидов в трех образцах суспензии (1—3), инкубировавшихся
в разных температурах:
А — 25 °С; Б — 18 °С; В — 10 °С. Ось абсцисс — время инкубирования образцов сперматозоидов, ч; ось ординат — доля неметящихся ядер


В качестве примера на рис. 31.3 представлена динамика метки йодистым пропидием в трех образцах суспензии сперматозоидов вьюна, инкубировавшихся при различных температурах. Для определения состояния митохондрий сперматозоидов к 5 мкл контрольной, инкубировавшейся с токсикантом суспензии либо суспензии, полученной от контрольных или тестируемых рыб, добавить 5 мкл раствора родамина 123.
Для определения острого цитотоксического эффекта к 5 мкл суспензии интактных сперматозоидов добавить 5 мкл раствора токсиканта и далее — 10 мкл раствора родамина 123. Пять полей зрения фотографировать в видимом и возбуждающем специфическую люминесценцию свете (максимум возбуждения — 507 нм, максимум эмиссии — 529 нм).

Рис. 31.4. Изменение доли метящихся родамином 123 клеток по мере инкубирования суспензии сперматозоидов вьюна при температуре 25 °С (А),
18 °С (Б)н 10 *С (В).
Разброс значений аппроксимирован линейной зависимостью, уравнение которой указано в поле каждого графика. Ось ординат — доля метящихся родамином 123 клеток; ось абсцисс — время в часах. На графиках приведены уравнения линейной зависимости, наилучшим образом аппроксимирующими разброс

Изображения одной области совместить на компьютере и определить долю метящихся родамином структур.
Как следует из рис. 31.4, численность метящихся родамином 123 сперматозоидов остается неизменной на протяжении довольно длительного периода существования суспензий in vitro. Сделать выводы об изменении скорости сперматозоидов рыб, находящихся в среде с токсикантом относительно контрольного уровня. Сравнить состояние мембран и митохондрий сперматозоидов рыб, находящихся в контрольной и тестируемой средах.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Еськов А. П. Метод определения активности суспензий клеток, обусловленный их собственной подвижностью / А. П. Еськов [и др.] // Бюлл. эксп. биол. и мед. — 1984. — Т. 97. — № 6.
Каюмов Р. И. Токсикологическая оценка индивидуальных химических соединений и смесей сложного состава с использованием подвижного клеточного тест-обьекта / Р. И. Каюмов [и др.] // Бюлл. эксп. биол. и мед. — 1988. -Т. 104. — № 1.
Турдаков А. Ф. Воспроизводительная система самцов рыб. — Фрунзе: Илим, 1972.
Tannenbaum L. V Rodent sperm analysis in field-based ecological risk assessment: pilot study at Ravenna army ammunition plant / L.V. Tannenbaum [et al.] // Environ Pollut, 2003. — V. 123. 

Еще по теме Лабораторная работа №31. СПЕРМАТОЗОИДЫ КОСТИСТЫХ РЫБ КАК ТЕСТ-ОБЪЕКТ В ЭКОЛОГО-ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИХИССЛЕДОВАНИЯХ {Методика разработана Ю. К. Дорониным):

1. 4.6. Методики, разработанные А. В. Крушинским для изучения способности животных к поиску приманки, исчезающей из поля зрения
2. 6.4.2. Особенности человека как объекта генетических исследований
3. 17.2. ЧЕЛОВЕК КАК ОБЪЕКТ ДЕЙСТВИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ. АДАПТАЦИЯ ЧЕЛОВЕКА К СРЕДЕ ОБИТАНИЯ
4.   Тест на билирубин с использованием полосок Билуген-тест или мультитестовых полосок. 
5. КОСТИСТЫЕ РЫБЫ
6. КОСТИСТЫЕ РЫБЫ — TELEOSTEI
7. КОСТНЫЕ И КОСТИСТЫЕ
8.   Количественное определение афлатоксинов В( и G( в кормах. Метод разработан Н. А. Соболевой.  
9. ОРГАНИЗАЦИЯ И ВЕДЕНИЕ ЭКОЛОГО-МЕЛИОРАТИВНОГОМОНИТОРИНГА ОСУШЕННЫХ ЗЕМЕЛЬГОСЛЕСФОНДА БЕЛАРУСИ
10. ЦИЛИАТОЗЫ РЫБ Хилоденеллез рыб
11. ЭКОЛОГО-ТАКСОНОМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ПОЧВЕННОЙ ФАУНЫ
12. Использование разработанных подходов и методовдля экологической оценки микробныхсообществ наземных экосистем
13. Эколого-ценотические стратегии вилов и популяций растений
14. Тест 1.
15. НЕКОТОРЫЕ ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИЕ ВОДНЫЙ РЕЖИМ РАСТЕНИЙ
16.   ОБЪЕКТЫ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ