Лабораторная работа №32. ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙАНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВ (Методика разработана А. Л. Степановым)

В лабораторных условиях принято определять потенциальную активность азотфиксации, денитрификации, метаногенности и эмиссии С02. Наиболее удобным и простым является ацетиленовый метод. Нитрогеназа — азотфиксирующий ферментный комплекс диазотрофных бактерий — способна разрушать тройную связь не только молекулярного азота, но и других соединений, в частности ацетилена. Константа Михаэлиса для реакции восстановления ацетилена примерно в 10 раз ниже, чем для редукции азота, а растворимость ацетилена почти в 60 раз выше, чем для азота (при 20 и 1 атм в 1л воды растворяется около 1000 мл ацетилена и только 15 мл азота). Вследствие этого при наличии в газовой фазе уже 5 % ацетилена восстановление молекулярного азота полностью тормозится и протекает только образование этилена. Фиксации одной молекулы азота соответствует образование трех молекул этилена, и, следовательно, коэффициент пересчета от аце- тиленредукции к азотфиксации равен трем.
Этилен анализируется на газовом хроматографе; при этом чувствительность обнаружения нитрогеназы составляет 10~9 М, что на несколько порядков выше по сравнению с методом Кьельдаля и даже изотопного (15N) метода анализа.
Самым распространенным для оценки денитрифицирующей активности почвенных микроорганизмов является метод, основанный на использовании ацетилена в качестве ингибитора редуктазы закиси азота, что позволяет судить об активности процесса по накоплению закиси азота (N20) в газовой фазе.
Цель работы — определение биологической активности почв на разном удалении от источника загрязнения по азотфиксирую- щей (1) и денитрифицирующей (2) активности почвенного мик- робоценоза, а также по эмиссии С02 (3).
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
Оборудование, материалы и реактивы:
ацетилен технический в баллонах; этилен и пропан хроматографически чистые для эталонирования прибора; карбид кальция СаС2; газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором (колонка 3,2 м, внутренний диаметр 2 мм, наполнитель Spherosil- 200), расход газов, мл/мин: Ат — 25, Н2 — 30, воздуха — 40); аргон, водород в баллонах или генератор водорода типа СГС-2; сжатый воздух из компрессора или из баллона; шприцы медицинские туберкулиновые или инсулиновые на 0,5—1,0 мл, а также объемом 15 — 20 мл; флаконы пенициллиновые с пробками и зажимами к ним. [****]
тивности азотфиксации для трех параллельных проб характеризует потенциальную активность азотфиксации в изучаемой почве. Об активности азотфиксации судят по скорости эмиссии этилена. Объем вводимой пробы — 0,5 мл. Активность азотфиксации выражается в миллиграммах азота в форме N° 2 в 1 части почвы через 1 ч (NVl г почвы-ч). Расчет активности азотфиксации (А, мг N—N2/г • ч) провести по формуле

где X — показание прибора, см; S — чувствительность прибора; Кс2н4 = 1,069-10 " моль С2Н4/см = 3,21 • 10-пмоль N/cm = 8,98 -10-10 г N/cm; 2 — коэффициент пересчета вносимой пробы, мл; V — объем газовой фазы над почвой во флаконе, 10 мл; т — масса почвы в пробе, г; t — время инкубации, ч.

Определение потенциальной активности денитрификации
Оборудование, материалы и реактивы:
газовый хроматограф с детектором по теплопроводности или с электронным захватом; гелий в баллонах; шприцы для газовой хроматографии; флаконы объемом 250 и 15 мл; закись азота в баллоне для эталонирования прибора; глюкоза, нитрат калия. Навески почвы по 5 г, предварительно освобожденные от инородных включений, поместить во флаконы объемом 15 мл. Каждый образец почвы увлажнить 6 мл водного раствора глюкозы и нитрата калия из расчета 2,5 мг и 0,4 мг на 1 г почвы соответственно. Флаконы закрыть резиновыми пробками, зафиксировать стальными зажимами и вытеснить воздух путем пропускания аргона при давлении 1 атм в течение 30 с через входную и выходную иглы, вставленные в резиновую пробку. В каждый флакон ввести 1 мл ацетилена, предварительно отобрав из флакона адекватный объем газа. Флаконы встряхивать в течение 30—60 с, переворачивая пробкой вниз, и инкубировать при 28 °С в течение 24 ч. По истечении этого времени провести анализ газовой пробы на газовом хроматографе. Перед началом анализа флаконы тщательно встряхнуть. Объем вводимой пробы — 0,5 мл. Об активности денитрификации (А, мкг N—N20/r • ч) судить по скорости эмиссии закиси азота по формуле

где X — показание прибора; KN2o = 1, 66 • 10~12 моль = 7,31 - 10-11 г N—N20; 2 — коэффициент пересчета вносимой пробы, мл; V —

объем газовой фазы над почвой во флаконе, 10 мл; т — масса почвы в пробе, г; t — время инкубации, ч.
3. Определение потенциальной эмиссии СОг
Оборудование, материалы и реактивы:
газовый хроматограф с детектором по теплопроводности: колонка 3,2 м, диаметр 1мм; наполнитель полисорб—1, расход газов: Не — 20 мл/мин; раствор глюкозы. Навеску свежеотобранной почвы по 5 г от каждого образца, освобожденной от инородных включений, поместить во флаконы объемом 15 мл. В пробы добавить по 1 мл раствора глюкозы из расчета 2,5 мг/г почвы. В течение часа инкубировать с резиновой пробкой в термостате при 28 °С, закрыв флаконы резиновыми пробками. Эмиссию С02 оценить на газовом хроматографе. Объем вводимой пробы — 0,5 мл. Активность оценить по эмиссии С02 (А), выражая в мкг С—С02/1 г - ч по формуле

где X — показание прибора; Кс0г = 1, 07- 10-11 моль 1,29-1011 г С—С02; 2 — коэффициент пересчета вносимой пробы, мл; V — объем газовой фазы над почвой во флаконе, 10 мл; т — масса почвы в пробе, г; / — время инкубации, ч.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Звягинцев Д. Г. Биология почв / Д. Г. Звягинцев [и др.]. — М.: Изд-во МГУ, 2005.
Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. Д. Г. Звягинцева. — М.: Изд-во МГУ, 1991.
Степанов А. Л. Методы газовой хроматографии в почвенной микробиологии / А. Л. Степанов, Л.В.Лысак. — М.: МАКС-Пресс, 2002.

Еще по теме Лабораторная работа №32. ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙАНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВ (Методика разработана А. Л. Степановым):

1. Микробиологическая диагностика и биологическая активность почв
2. Биологическая активность почв
3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВ
4. Поступление растительных остатков и биологическая активность почв
5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЦЕНОЗОВ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВ
6. 4.6. Методики, разработанные А. В. Крушинским для изучения способности животных к поиску приманки, исчезающей из поля зрения
7. ВАЖНЕЙШИЕ ИТОГИ РАБОТЫ КАФЕДРЫ БИОЛОГИИ почв Н. А. Красильников
8. РЕЗУЛЬТАТЫ НАУЧНОЙ И ПЕДАГОГИЧЕСКОЙ РАБОТЫ КАФЕДРЫ ФИЗИКИ И МЕЛИОРАЦИИ ПОЧВ А. Ф. Вадюнина
9. ИНВЕРТАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ТОРФЯНЫХ ПОЧВ БОЛОТА «ТАГАН» Е. Ю. Старикова, Е. В. Порохина, О. А. Голубина
10. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ИНДИКАЦИИИ ДИАГНОСТИКИ ПОЧВ
11. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ИНДИКАЦИЯЗАГРЯЗНЕНИИ ПОЧВЕННОЙ СРЕДЫИ САМООЧИЩЕНИЕ ПОЧВ
12. Изучение биологически активных соединений — ферментов и антибиотиков. Создание новых методов
13. РАСТИТЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ IN VITRO ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ИЗ ТОРФА О.              А. Рожанская
14. Биологическая индикация загрязнения почвенной среды и самоочищения почв
15. МИКРОЭЛЕМЕНТНЫЙ СОСТАВ ТОРФОВ БАКЧАРСКОГО БОЛОТА В.              А. Степанова, Н. Г. Коронатова
16.   Количественное определение афлатоксинов В( и G( в кормах. Метод разработан Н. А. Соболевой.  
17. Использование разработанных подходов и методовдля экологической оценки микробныхсообществ наземных экосистем
18. СВЕДЕНИЯ О ГЕЛЬМИНТОЗАХ ЛАБОРАТОРНЫХ ГРЫЗУНОВ
19. 3 ГИГИЕНА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
20. Организация оплодотворения самок в лабораторных условиях