Лабораторная работа №39. ИССЛЕДОВАНИЕГУМОРАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТАБЕСПОЗВОНОЧНЫХ И ПОЗВОНОЧНЫХ ГИДРОБИОНТОВМЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА {Методика предложена А. А. Киташовой, А. В. Киташовым и И. А. Кондратьевой)

Исследование гемолимфы мидий, перивисцеральной жидкости морских звезд и сыворотки крови рыб методом электрофореза позволяет выявить фракции белка, присутствующие в одних группах животных и отсутствующие в других группах.

Принцип электрофореза состоит в следующем. Вначале проводят электрофоретическое разделение смеси белков в забуференном агаровом геле. После разделения в канавку, которая идет в направлении миграции белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дуги (линии) преципитации. Число, положение и форма этих линий дает представление о составе исходной смеси антигенов (рис. 39.1) Если в электрофореграмме исследуемых образцов появляются новые полосы по сравнению с электрофореграммами образцов интактных животных, то их исследуют с помощью иммунохимического и биохимического анализа (определяют молекулярную массу по стандарту молекулярных масс в электрофорезе; выделяют белок из сыворотки, определяют его аминокислотную последовательность).
При исследовании целомической жидкости водных беспозвоночных животных и сыворотки крови рыб электрофорез в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях проводят при концентрации разделяющего геля 15 %, благодаря чему становится возможным обнаружить низкомолекулярные (до 10 кДа) белковые фракции. Гемолимфу мидий и перивисцеральную жидкость морских звезд берут в наибольшей возможной концентрации в связи с низким содержанием белков; сыворотку крови рыб разводят в 10—20 раз. На рис. 39.2 представлен пример электрофоре- граммы сывороток крови рыб, стрелками указаны новые белковые фракции, отсутствующие у контрольных экземпляров.
В качестве объектов используются представители массовых видов беспозвоночных и низших позвоночных животных. Правила работы с беспозвоночными животными приведены в этой лабораторной работе.
В качестве представителей группы рыб выбраны северная навага Eleginus navaga Pallas и беломорская треска Gadus morhua maris-
Рис. 39.1. Принцип иммуноэлект-
рофореза.
Первый этап: электрофорез в агаровом геле материала, состоящего из смеси антигенов, а-б-в. Забуференный гель — белое поле; лунка с антигенами — черный цвет; разделенные фракции заштрихованы. Второй этап: двойная диффузия с использованием подходящей иммунной сыворотки, А- Б-В. Получены дуги преципитации: антигена а с антителами А, антигена б с антителами Б, антигена в с антителами В

Рис. 39.2. Электрофореграмма
сыворотки крови рыб:
А — контрольная группа (здоровая
радужная форель); Б — эксперимен-
тальная группа (радужная форель,
заболевшая энтеритом)
albi D., распространенные в Белом море, а также пресноводная радужная форель Salmo gairdneri R., широко используемая при промышленном разведении. Радужная форель является хорошей моделью для изучения иммунных реакций при бактериальной инфекции, так как обычно разводимые в прудовых хозяйствах рыбы характеризуются низкой зараженностью паразитами, но у них часты бактериальные инфекции из-за высокой плотности посадки рыб, нарушений температурных и иных условий содержания и воздействия таких стрессовых факторов, как перевозки. Моделью для изучения иммунореактивности при паразитарной инвазии выбраны морские рыбы в естественных условиях обитания — навага и треска Белого моря. Для естественных условий обитания менее свойственны инфекционные болезни, однако паразиты являются характерными симбионтами морских рыб.
Оборудование и материалы:
2%-й агаровый золь; сыворотка крови рыб; антисыворотки против иммуноглобулинов рыб; агар на барбиталовом буфере с pH 8,6, 2%-й; барбиталовый буфер pH 8,6; красители: бромфеноловый синий и кумасси ярко-голубой; прибор для электрофореза; влажная камера; предметные стекла; нивелирный столик; штампы для пресечения лунок и бороздок; пипетки.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ Тщательно очищенные и обезжиренные предметные стекла поместить на нивелирный столик. Агар на барбиталовом буфере

расплавить на водяной бане и с помощью предварительно нагретой пипетки вылить на предметное стекло 4 мл горячего агарового золя. После затвердения геля с помощью штампа вырезать лунку диаметром 4 мм для антигенов и на расстоянии 3—4 мм от нее канавку для антисыворотки (40x2 мм, боковые стенки не прорезают). Столбик геля удалить из лунки с помощью водоструйного насоса, а гель в канавке оставить, чтобы не нарушить тока во время фореза. В лунку внести 20 мкл смеси антигенов с помощью пипетки. Добавить также 2 мкл бромфенолового синего в качестве маркера. Стекла поместить в электрофоретическую камеру, электродные отсеки заполнить барбиталовым буфером с pH 8,6 и соединить гель с буфером с помощью полосок фильтровальной бумаги. Хорошее разделение белков сыворотки обычно происходит за 1,5 ч при напряженности поля 7В/см (около 60 В на стекло). После электрофоретического разделения белков из продольной канавки удалить агар и внести в нее 50—80 мкл антисыворотки.

Иммунодиффузию проводят в течение 12—24 ч во влажной камере. Сразу начать элюцию белков, которые не участвовали в преципитации. Гель высушить и окрасить кумасси. Проанализировать результаты нижеизложенными способами.
Использование чистых антигенов
Применяя одно лишь окрашивание, часто не удается идентифицировать неизвестный антиген. В этом случае может помочь сравнение исследуемой смеси антигенов с известными чистыми антигенами. Реагенты располагают, как показано на рис. 39.3.
Применение моноспецифических иммунных сывороток
Индивидуальные линии преципитации могут быть идентифицированы с помощью применения подходящих моноспецифиче-

ских антисывороток, находящихся на том же стекле, но в других параллельных канавках (рис. 39.4). Линия преципитации, образованная на одной стороне иммуноэлектрофореграммы полиспеци- фической сывороткой, может слиться с другой линией, которую на противоположной стороне образует моноспецифическая сыворотка. Такое слияние говорит об идентичности данного компонента антигенной смеси тому антигену, к которому была получена моноспецифическая антисыворотка.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Отбор проб
Техника отбора гемолимфы мидий и перивисцеральной жидкости морских звезд приведена в справочном материале к лабораторной работе № 38.
Для взятия крови у рыб и получения сыворотки животное обтирают сухой салфеткой. Взятие крови проводят либо прижизненно из хвостовой артерии (с помощью шприца, промытого гепарином, или надрезают хвост), либо для получения больших объемов крови рыбу усыпляют, делают разрез в районе сердца с брюшной стороны, сердце иссекают ножницами, затем пастеркой с грушей или автоматической пипеткой собирают кровь и сгустки.
Методика взятия крови для сыворотки различна для рыб и млекопитающих. Взятую кровь следует сразу поместить в холодильник (4 °С). Сгусток образуется через сутки. Всю отделившуюся жидкость собирают пастеркой и центрифугируют при 6 000 g в течение 5 мин. Надосадок (сыворотку) разливают по аликвотам и замораживают при -70 °С. В зависимости от условий эксперимента допускается хранение сыворотки при -20 °С в течение краткого периода времени.
Внимание! Размораживать сыворотку нельзя, так как при этом снижается активность ферментов, и для определения лизоцима и других белков такая сыворотка не годится.
Приготовление гелей
Гель готовят так же, как и для обычной иммунодиффузии, за исключением того, что вместо NaCl добавляют подходящий буферный раствор. Используют высококачественные марки агаров или агарозы. В отдельных случаях вместо агара рекомендуют добавлять агарозу, если необходимо на стадии электрофореза избежать явления электроэндосмоса. Обычно используют 1 — 2%-ю концентрацию гелирующего агента. Рекомендуют применять барбитало- вый или боратный буфер с pH от 6 до 9. Так, для анализа сыворотки используют барбиталовый буфер (pH 8,2, ионная сила 0,025) с добавлением мертиолята в соотношении 1:10000. Концентрацию буфера подбирают таким образом, чтобы, с одной стороны, избежать колебаний pH, возникающих при низких его концентрациях, а с другой — перегрева геля во время электрофореза в случае его высоких концентраций.
Готовить агар желательно только для одного эксперимента, поскольку многократное разогревание перед каждым опытом приводит к испарению жидкости и изменению концентрации физико-химических свойств агара.
Приготовление барбиталового буфера, pH 8,6
В состав буфера входят: 5,5-диэтилбарбитуровая кислота (бар- битал) — 30 г; 5,5-диэтилнатрийбарбитурат (барбитал натрия) — 155 г; азид натрия — 10 г; лактат кальция — 3 г; дистиллированная вода — 10 л.
Приготовление растворов для окрашивания белков
Бромфеноловый синий (0,1%-й): 10 мг бромфенолового синего растворить в 10 мл барбиталового буфера.
Кумасси ярко-голубой: кумасси ярко-голубого R-250—1,25 г растворить в 50 мл ледяной уксусной кислоты и добавить 185 мл дистиллированной воды.
Растворы хранить не больше нескольких недель в закрытой колбе. После многократного применения они могут быть вновь использованы после пропускания через фильтр.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Воробьева Н. В. Руководство по иммунодиффузии и иммуноэлектрофорезу. — М.: МГУП, 2000.
Иммунологические методы / под ред. Х.Фремеля. — М.: Мир, 1979.
Коротяев А. И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / А. И. Коротяев, С.А. Бабичев. — СПб.: Спец, литература, 1998.
Остерман Л. А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. — М.: Наука, 1983.
Практикум по иммунологии / под ред. И. А. Кондратьевой, А.А.Яри- лина. — М.: Издательский центр «Академия», 2004.
Руководство по количественному иммуноэлекгрофорезу. Методы и применение / под ред. Н. Аксельсен, И. Крелль, Б. Веке. — М.: Мир, 1977.

<< | >>

Источник: О. П. Мелехова, Е. И. Егорова, Т. И. Евсеева. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование : учеб, пособие для сгуд. высш. учеб, заведений. 2007

Еще по теме Лабораторная работа №39. ИССЛЕДОВАНИЕГУМОРАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТАБЕСПОЗВОНОЧНЫХ И ПОЗВОНОЧНЫХ ГИДРОБИОНТОВМЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА {Методика предложена А. А. Киташовой, А. В. Киташовым и И. А. Кондратьевой):

- Геоэкология - Основы экологии - Экологический мониторинг - Экология животных - Экология насекомых - Экология почв и агроэкология - Экология птиц - Экология рыб -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -