Лабораторная работа №40. ОПРЕДЕЛЕНИЕКОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХГИДРОБИОНТОВ В ОТВЕТ НА ИЗМЕНЕНИЕ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ {Методикапредложена А. В. Киташовым и А. А. Киташовой)

Общую концентрацию белка в гемолимфе, перивисцеральной жидкости и сыворотки крови беспозвоночных и позвоночных животных принято определять с помощью стандартных методов (метод Лоури, метод Брэдфорд, спектрофотометрическое определение концентрации белка).

Принцип метода заключается в увеличении синтеза общего белка в плазме и перивисцеральной жидкости животных при стрессе, заболеваниях, нарушающих поддержание постоянства внутренней среды организма.
Для моделирования неблагоприятных условий окружающей среды гидробионтов (морских звезд, пресноводных моллюсков) содержат в лабораториях в аквариумах, где экспериментально ухудшают условия содержания с целью стимуляции у них иммуно- защитных реакций. В лабораторной работе предложен метод оценки динамики общей концентрации белка в перивисцеральной жидкости морских звезд в ответ на ухудшение условий содержания и введение антигенов. Аналогичные эксперименты возможны и на пресноводных животных. Техника забора перивисцеральной жидкости представлена в лабораторной работе № 38.
Для активации иммунозащитных реакций беспозвоночным животным вводят различные антигены, растворенные в стерильной профильтрованной морской воде. Контрольным группам вводят равный объем морской воды или оставляют животных интактными. Активация иммунного ответа у рыб происходит естественным образом — патогенными микроорганизмами при бактериальной инфекции у радужной форели и продуктами метаболизма паразитов при инвазии у морских рыб (наваги и трески). Для определения наличия патогенных микроорганизмов и паразитов у рыб проводят дополнительные исследования: бактериологические и паразитологические.
У морских звезд (пресноводных моллюсков), содержавшихся в условиях, приближенных к естественным, при введении различных антигенов в перивисцеральной жидкости общая концентрация белка не изменяется (рис. 40.1, белые столбики). Ухудшение условий содержания приводит к возрастанию концентрации общего белка в перивисцеральной жидкости гидробионтов. Наибольшее влияние на них оказывает пониженная аэрация (черные*стол- бики на рис. 40.1): у опытных животных увеличивается количество белка независимо от природы вводимого антигена.
Оборудование, материалы и растворы:
исследуемая гемолимфа, целомическая жидкость или сыворотка крови (см. справочный материал к лабораторным работам № 38 и 39); физиологический раствор; дистиллированная вода; стеклянные пробирки; автоматические пипетки на 100—1000 мкл; бумажные фильтры; фарфоровая ступка с пестиком; спектрофотометр или фотометр (КФК); антигены (бычий сывороточный альбумин (БСА), липополисахарид (ЛПС),эритроциты человека (ЭЧ)

Рис. 40.1. Общая концентрация белка в перивисцеральной жидкости морских звезд в зависимости от условий содержания и от введенного антигена


или барана (ЭЧ)); культура клеток Saccharomyces cerevisiae, черная тушь, профильтрованная через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 45 мкм морская вода; аквариумы (100 л); бензин; компрессор для аквариумов; термометр для воды; лабораторные животные — морские звезды (10 шт. на аквариум).
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ Для определения концентрации белка спектрометрическим методом пробы исследуемых жидкостей развести профильтрованной через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 45 мкм морской водой до концентрации, попадающей в интервал чувствительности спектрофотометра или КФК. Определить оптическую плотность пробы при длинах волн 280 и 260 нм. Рассчитать концентрацию белка в пробе по формуле: С= 1,45?gt;28о ~ 0,74Z)260i где С — концентрация белка в пробе (мг/мл), Д28о и Або — оптическая плотность пробы при длине волны 280 и 260 нм соответственно; 1,45 и 0,74 — коэффициенты молярной экстинкции белков и нуклеиновых кислот при соответствующих длинах волн. Морских звезд разделить на 4 группы и поместить в отдельные аквариумы. В аквариум, где содержатся животные группы 1, добавить в качестве загрязняющего агента бензин (0,003 %); в аквариуме, где содержатся животные группы 2, повысить температуру воды до 15 °С; в аквариуме, где содержатся животные группы 3, уменьшить аэрирование воды; группа 4 — контроль.

Для стимуляции иммунных реакций животным каждой группы вводят любые антигены (БСА, ЛПС, ЭЧ или ЭБ, суспензию клеток S. cerevisial, черную тушь) или профильтрованную морскую воду. Через 24 ч отобрать пробы перивисцеральной жидкости (см. справочный материал к лабораторной работе № 38) и провести сравнительный анализ концентрации общего белка у контрольных и экспериментальных животных. В ответ на ухудшение условий обитания у морских звезд обнаруживается увеличение концентрации общего белка в перивисцеральной жидкости. Этого не происходит при введении антигенов различной природы, что свидетельствует об активизации имму- нозащитных врожденных реакций организма.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Приготовление и введение антигенов мидиям и морским звездам
В качестве антигенов служат: бычий сывороточный альбумин (БСА), эритроциты человека (ЭЧ) или эритроциты барана (ЭБ), липополисахарид (ЛПС) из клеточных стенок грамотрицатель- ных бактерий Salmonella typhimurium, клетки Saccharomyces cerevisiae, черная (китайская) тушь.
Растворы и суспензии антигенов готовят на физиологическом растворе или морской воде, которые стерилизуют фильтрованием через нитроцеллюлозный фильтр с порами диаметром 45 мкм.
Существует два принципиально различающихся способа введения антигена в организм мидии: с помощью шприца в полость тела (в области перикарда делают надпил) или в фильтруемый раствор. Во втором случае антиген определенной концентрации добавляют в воду аквариума (объем известен), где содержится определенное количество моллюсков, чтобы можно было рассчитать, сколько антигена приходится на одно животное.
В экспериментах используют следующие дозы антигенов:

Антиген	Концентрация	Доза раствора на животное
		мидия	Морская звезда
БСА	Раствор, 8 мкг/мл Раствор, 80 мкг/мл	0,2 мл 0,2 мл	мл мл
ЭЧ или ЭБ	Суспензия, 200— 500 млн ют./мл	0,2 мл	1 мл
ЛПС	Раствор, 100 мкг/мл	0,2 мл	1,2 мл
Клетки Saccharomyces cerevisiae	Суспензия, 120—130 млн кл./мл	0,2 мл	1,2 мл
Черная (китайская) тушь	0,1 %-й раствор туши на аквариум	0,1%	—

Перед введением раствора морскую звезду необходимо слегка обтереть сухой салфеткой. Следует помнить, что при сильном сдавливании луча звезды, особенно у основания, может произойти его автоампутация, что сделает животное непригодным для дальнейших экспериментов.
Раствор или суспензию антигена вводят в целом животного при помощи шприца в объеме, не превышающем 1 — 1,5 мл. Иглу вводят с аборальной стороны от второй трети луча на 5—10 мм в направлении центра под углом 30—50° к поверхности тела. Ход иглы должен быть плавным, чтобы не повредить внутренние органы животного. После извлечения иглы нужно несколько минут подержать звезду вверх тем лучом, в который производилась инъекция, чтобы уменьшить вытекание жидкости.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Беккер Г. Практикум по органической химии. Т.1. — М.: Мир, 1979.
Иммунологические методы / под ред. Х.Фремеля. — М.: Мир, 1979.
Кондратьева И. А. Функционирование и регуляция иммунной системы рыб / И. А. Кондратьева, А. А. Киташова // Иммунология, 2002. — № 2.
Практикум по иммунологии / под ред. И. А. Кондратьевой, А. А.Яри- лина. — М.: Издательский центр «Академия», 2004.
Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. 

Еще по теме Лабораторная работа №40. ОПРЕДЕЛЕНИЕКОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХГИДРОБИОНТОВ В ОТВЕТ НА ИЗМЕНЕНИЕ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ {Методикапредложена А. В. Киташовым и А. А. Киташовой):

1. Анализ среды обитания животных
2. СПЕЦИФИКА ПОЧВЫ КАК СРЕДЫ ОБИТАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
3. ФАКТОРЫ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ СРЕДЫ Вода как среда обитания животных
4. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ИНДИКАЦИЯЗАГРЯЗНЕНИИ ПОЧВЕННОЙ СРЕДЫИ САМООЧИЩЕНИЕ ПОЧВ
5. 6.4. РОЛЬ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ И СРЕДЫ В ФОРМИРОВАНИИ НОРМАЛЬНОГО И ПАТОЛОГИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННОГО ФЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА
6. Биологическая индикация загрязнения почвенной среды и самоочищения почв
7. О. П. Мелехова, Е. И. Егорова, Т. И. Евсеева. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование : учеб, пособие для сгуд. высш. учеб, заведений, 2007
8. 1** С историей или без? Каверзные ответы
9. ОТВЕТЫ
10. 150 ВОПРОСОВ И ОТВЕТЫ НА НИХ
11. Изменение размеров животных с изменением температурных климатических условий. 
12. О СКОРОСТИ ОБНОВЛЕНИЯ БЕЛКА И ХЛОРОФИЛЛА В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ [24]
13. Биосинтез белка
14. Белка