Лабораторная работа №38. ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА БЕСПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ В ОТВЕТ НА НЕБЛАГОПРИЯТНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ. РЕАКЦИЯГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ {Методика предложена И. А. Кондратьевой и А. В. Киташовым)

Принцип реакции гемагглютинации (РГА) основан на том, что при взаимодействии эритроцитов и гемагглютининов в исследуемой жидкости происходит склеивание эритроцитов, в этом случае возможна полуколичественная оценка концентрации агглютининов. По результатам РГА судят о присутствии в исследуемой жидкости антител против поверхностных антигенов эритроцитов и говорят о титре антител — это последнее разведение исследуемой жидкости, при котором эритроциты склеиваются. Реакция высокочувствительна и позволяет определить наличие антител в концентрации 0,001 мкг/мл. Часто применяют модификации РГА, например пассивную РГА, когда эритроциты обрабатывают таниновой кислотой и нагружают антигеном, против которого следует выявить антитела, т.е. эритроциты используют в качестве индикатора.
В лабораторной работе представлен микрометод РГА для исследования гемолимфы и перивисцеральной жидкости беспозвоночных животных, однако и при исследовании сыворотки крови позвоночных животных, например рыб, ход работы точно такой же. У беспозвоночных гемагглютинирующая активность перивисцеральной жидкости, так же как и при исследовании сыворотки крови позвоночных, служит косвенным показателем иммунного статуса организма.
В качестве объектов используются представители массовых видов беспозвоночных животных (моллюски и морские звезды) и низших позвоночных животных (морские и пресноводные рыбы), относящиеся к разным систематическим группам и различающиеся образом*жизни. Их отлов производят в соответствии с правилами, изложенными в справочном материале к этой лабораторной работе. У беспозвоночных в отличие от позвоночных животных в основном выражены реакции врожденного иммунитета, важнейшую роль в котором играют амебоциты или гемоциты. У рыб впервые в эволюции обнаруживаются антитела — гуморальные факторы приобретенного иммунитета, синтезируемые клетками лимфоидной линии дифференцировки.
Обыкновенная съедобная мидия (Mytilus edulis L.) — один из наиболее распространенных видов двустворчатых моллюсков, в котором выделяются экологические и физиологические расы. Мидии являются донными биофильтраторами, через которые проходит очень большие объемы воды. При температуре около 20 °С одна мидия длиной 5 —6 см может профильтровать около 3 л воды в час. В полость тела при фильтрации воды могут попасть не только пищевые объекты, но и патогенные организмы — простейшие и бактерии.
Морские звезды ведут хищный образ жизни. Характерный представитель этой группы животных — морская звезда Asterias rubens L.
Материал и оборудование:
взвесь эритроцитов человека (ЭЧ) или эритроцитов барана (ЭБ); гемолимфа мидий или перивисцеральная жидкость морских звезд; физиологический раствор; морская вода; стандартные пипетки или микротитратор Такачи; камера Горяева; стеклянная пробирка; водяная баня; центрифуга; планшет круглодонный 96-луноч- ный.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ Гемолимфу или перивисцеральную жидкость центрифугировать при 5 000 g в течение 10 мин для осаждения клеток. Супернатант осторожно, чтобы не разрушить осадок, перелить в пробирку. Жидкость нагреть на водяной бане при 56 °С в течение 30 мин для разрушения лизинов. Обработанную таким образом гемолимфу или перивисцераль- ную жидкость титровать методом бинарных разведений в круглодонном 96-луночном планшете, используя микротитратор Така- чи. Для этого, начиная со второй лунки, в горизонтальные ряды планшета внести по 50 мкл физиологического раствора (рис. 38.1).
Затем по 50 мкл исследуемой жидкости добавить в первые две лунки. Жидкость 2-й лунки хорошо перемешать и 50 мкл перенести в 3-ю лунку, затем жидкость в 3-й лунке хорошо перемешать и 50 мкл перенести в 4-ю лунку и т. д. В последнюю, 12-ю лунку не добавлять жидкости из предыдущей лунки — это контроль. В результате вышеописанных манипуляций каждая лунка планшета должна содержать 50 мкл жидкости, причем первая лунка каждого ряда — соответствующий неразведенный образец, вторая — образец, разведенный вдвое, третья — вчетверо и так далее, до предпоследней лунки. Последняя лунка каждой строки, используемая в качестве контрольной, должна содержать физиологический раствор. Для постановки РГА получить эритроциты у преподавателя, отмыть физиологическим раствором, центрифугируя при 5 000 g в течение 5 мин, супернатант слить. Если эритроциты хорошо отмыты, супернатант после их осаждения практически бесцветен.
Внимание! ЭЧ следует хранить в консерванте (в соотношении 1 часть консерванта на 5 частей эритроцитов) под ватной пробкой при 4 °С. Концентрация осадка около 10 млрд клеток в 1 мл. Полученный осадок развести физиологическим раствором с таким расчетом, чтобы получить 3 —5%-ю взвесь эритроцитов.

Обычно на планшет достаточно 5 —6 мл 5%-й взвеси эритроцитов. В каждую лунку планшета добавить по стандартной капле (25 мкл) 5%-й взвеси эритроцитов.
Внимание! Суспензию эритроцитов необходимо постоянно перемешивать, не допуская оседания клеток. Содержимое лунок перемешать легкими круговыми движениями планшета в горизонтальной плоскости, после чего план-

Рис. 38.1. Титрование гемолимфы

СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Отлов и содержание животных
Исследование иммунозащитных реакций животных не рекомендуется проводить в период нереста. Отлов животных (мидий, морских звезд, морских рыб, пресноводных двустворчатых моллюсков) следует производить в день обследования в экологически чистых (контроль) и подверженных загрязнению (опыт) местах обитания. Пойманных животных нужно перевозить в емкостях с морской (или речной) водой. В каждую экспериментальную группу включают равное число полноценных здоровых особей примерно равного веса и размера. До постановки экспериментов животных содержат в условиях, максимально приближенных к естественным условиям обитания: каждую группу животных поместить в отдельный садок с диаметром ячейки 0,5 см, тщательно завязывают и опускают в водоем на глубину 2-5 м, привязав веревкой к плавучему причалу. Длину веревки выбирают с учетом возможного наибольшего подъема воды во время прилива, так чтобы садок не отрывался от дна (для морских звезд) или свободно висел (для мидий и рыб). Животных не рекомендуется размещать в местах, подверженных антропогенному загрязнению. Необходимо вести протокол наблюдений, в котором указывается, где отловлены животные, как долго и в каких климатических условиях они содержались до обработки (температура и соленость воды, расписание приливов и отливов, температура воздуха, атмосферное давление и т.п.), состояние экспериментальных животных. Пресноводных рыб (радужную форель) содержат в открытых долевых садках небольшими группами. При этом необходимо строго соблюдать температурный режим.
В течение непродолжительного времени допускается содержание животных в лабораторных условиях. Однако следует учитывать, что водные животные очень чувствительны к ухудшению условий среды обитания, и поэтому при проведении экспериментальных работ необходимо придерживаться ряда требований: менять воду в аквариуме не реже 1 раза в сутки, обогащать воду кислородом, температура в помещении не должна превышать 10 СС, не допускается помещать в один аквариум животных из разных экспериментальных групп, нельзя содержать морских звезд и рыб на воздухе дольше 10—15 мин. Работать следует только в резиновых перчатках, чтобы избежать стрессового воздействия на хладнокровных животных.
Отбор проб
Для взятия гемолимфы у мидий (или пресноводных двустворчатых моллюсков) животное сначала обтирают сухой салфеткой.
Аккуратно приоткрыв створки раковины скальпелем, сливают воду из мантийной полости в стакан. Делают разрез вдоль всей створки раковины, разрезав мышцы-замыкатели. Собирают вытекающую гемолимфу в лунку 6-луночного планшета. Измеряют объем полученной гемолимфы. Он может сильно варьировать у мидий одинакового размера. Например, при использовании в опытах мидий длиной 5 —7 см объем гемолимфы может быть 1,5—4,5 мл. Подсчитывают гемоциты в камере Горяева и определяют их концентрацию в миллилитре объема.
Морских звезд перед взятием перивисцеральной жидкости слегка обтирают сухой салфеткой. Забор жидкости осуществляют шприцем. Иглу вводят в направлении от центра на расстоянии 5—10 мм в дистальный конец луча с аборальной стороны под углом SOSO" к поверхности тела. От одного животного получают не более 1 —1,5 мл перивисцеральной жидкости. Гемолимфа представляет собой прозрачную и бесцветную, слегка опалесцирующую жидкость, не содержащую крупных примесей и темной взвеси. Для каждого животного берут чистую иглу.
Внимание! При взятии перивисцеральной жидкости необходимо следить за тем, чтобы конец введенной иглы не касался внутренней поверхности целома и печеночных выступов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Галактионов В. Г. Иммунология. — М.: Издательский центр «Академия», 2003.
Кондратьева И. А. Современные представления об иммунитете рыб / И. А. Кондратьева [и др.] // Вестник Моек, ун-та. Сер.биол., 2001. — № 4.
Иммунологические методы / под ред. Х.Фремеля. — М.: Мир, 1979.
Практикум по иммунологии / под ред. И. А. Кондратьевой, А.А.Яри- лина. — М.: Издательский центр «Академия», 2004.
Хаитов Р. М. Экологическая иммунология / Р. М. Хаитов [и др.]. — М.: ВНИРО, 1995.
ЯрилинА.А. Основы иммунологии. — М.: Медицина, 1999.

<< | >>

Источник: О. П. Мелехова, Е. И. Егорова, Т. И. Евсеева. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование : учеб, пособие для сгуд. высш. учеб, заведений. 2007

Еще по теме Лабораторная работа №38. ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА БЕСПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ В ОТВЕТ НА НЕБЛАГОПРИЯТНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ. РЕАКЦИЯГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ {Методика предложена И. А. Кондратьевой и А. В. Киташовым):

- Геоэкология - Основы экологии - Экологический мониторинг - Экология животных - Экология насекомых - Экология почв и агроэкология - Экология птиц - Экология рыб -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -