Лабораторная работа № 23. БИОТЕСТИРОВАНИЕЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ С ПОМОЩЬЮ РЯСКИ МАЛОЙ(iLEMNA MINOR L.) (Методика разработана Л. В. Цаценко)

Представители семейства рясковых являются самыми маленькими цветковыми растениями в мире. В результате гидрофильной эволюции они достигли крайней степени редукции всех органов, поэтому по простоте строения занимают первое место среди цветковых растений.

Это — водные, свободно плавающие, многолетние травянистые растения.
Вегетативное тело рясковых называется листецом. Листецы одиночные или собраны в небольшие группы с помощью гиалиновой нити — тонкого выроста мембраны. Листецы состоят из паренхимных клеток хлоренхимы, разделенных большими межклеточными полостями, заполненными воздухом. Проводящая система неразвита. Корни развиты слабо и не достают грунта, по строению простые, одинарные (у многокоренника их число составляет от 3 до 10), отходят от брюшной поверхности листеца, зеленые, поскольку содержат хлорофилл. Рясковые — растения космополиты, распространены по всему свету. Вегетативное тело по виду напоминает крошечный плавающий лист или слоевище низших растений, поэтому длительное время их считали водорослями.
Листецы рясковых либо одиночные, либо соединены в небольшие группы. Форма листецов может быть почковидной или шаровидной. Цветение у рясок наблюдается крайне редко. Плоды хорошо видны невооруженным глазом, они чуть больше макового зернышка.
Ряску называют «экологической дрозофилой». Особенности морфологического строения, высокая скорость размножения, чувствительность к среде обитания — все это сделало ряску удобным

объектом для биологического тестирования. Семейство рясковых содержит более 40 видов, из них в России обитает только 5 видов (Lemna minor L., L. trisulca L., L. gibba L., Spirodela polyrrhiza L., Wolffia arrhiza L.).
Ряска малая (Lemna minor L.) — растение, плавающее на воде. Размер листецов (см. справочный материал к лабораторной работе № 23) 2 — 4 мм. Число жилок 3 (рис. 23.1). Листецы плоские, образуют группы из 3 — 6 растений. Встречается в стоячих водах. Корни длинные, но не достигают грунта, а выполняют главным образом функцию якоря, предотвращая переворачивание растений в воде. Встречается чаще всего в стоячих водах.
Рясковые размножаются преимущественно вегетативно, отдельный лист может пройти 10 делений за период 7—10 сут. Рясковые могут удваивать свою массу за время от 10 ч до 2 сут при оптимальных температуре, освещении и питании.
Принцип предложенного в данной лабораторной работе метода основан на определении гибели и изменений в темпах роста ряски малой, учете морфологических изменений (хлороз, некроз поверхности листеца, расслоение листецов) при воздействии токсических веществ в исследуемой среде по сравнению с контролем.
Острое токсическое действие исследуемой воды на ряску определяется по гибели ее за определенный период времени. Критерием острой токсичности служит гибель 50 % и более растений за 96 ч в исследуемой воде при условии, что в контроле погибло не менее 10 % растений.

Рис. 23.1. Строение ряски малой (Lemna minor L.):
А — общий вид; Б — группа листецов (один материнский и два дочерних); В — растение ряски в начале эксперимента; Г — растения ряски в конце эксперимента


В экспериментах по определению острого токсического действия устанавливают: среднюю летальную концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель 50 % и более тест-организмов; безвредную (не вызывающую эффекта острой токсичности) концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель не более 10 % тест-организмов.
Хроническое токсическое действие исследуемой воды на ряску малую оценивают по смертности и скорости роста за период до 24 сут в исследуемой воде по сравнению с контролем. Критерием хронической токсичности служит гибель 20 % и более тест-организмов и (или) достоверное отклонение в скорости роста из числа выживших растений по сравнению с контролем.
Биотестирование проводится в лабораторных условиях. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов. Температура окружающего воздуха в лаборатории от + 18 до + 25 °С. Атмосферное давление 84—106 кПа (630—800 мм рт.ст.). Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничено особыми требованиями. Освещенность для ряски 2 500 — 3 500 лк. Интенсивность света должна быть более чем на 15 % больше по сравнению с дневным светом.
Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению биотестирования включает подготовку посуды, пробоотборников, мест хранения отобранных проб, а также подготовку рабочего места для обработки доставленных в лабораторию проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключить попадание токсичных, органических и каких- либо других веществ в исследуемую воду.
Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Она промывается смесью бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью). Стенки посуды осторожно смачиваются хромовой смесью и через 2—3 ч посуда тщательно промывается водопроводной водой, нейтрализуется раствором пищевой соды и промывается 3 — 4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями. Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной, — в сушильном шкафу при 160СС в течение 1 ч.
Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающимися крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т. п. Вся грязная посуда после проведения анализов должна подвергаться стерилизации кипячением в течение 1 ч.
Культивационная вода используется для разведения маточной культуры, в качестве контрольной с добавлением питательного раствора для биотестирования, для разбавления исследуемых вод. Для подготовки культивационной воды питьевую воду отстаивают в течение 3 — 7 сут (до полного дехлорирования) в бутыли из бесцветного стекла. При отсутствии питьевой воды удовлетворительного качества допускается использование поверхностной пресной или грунтовой воды, отобранной вне зоны влияния источников загрязнения и профильтрованной через фильтр с размером пор 3,5 мкм.
В культивационной воде должны отсутствовать органические загрязняющие вещества, хлор, токсические вещества и антагонистические для ряски организмы (синезеленые водоросли, простейшие, многоклеточные); pH быть в пределах 4,5 —7,0, температура (20 + 5) °С.
Прежде "чем приступить к биотестированию на представителях семейства рясковых, ознакомьтесь с терминами и понятиями, применяемыми в данной лабораторной работе, которые приведены в справочном материале.
Оборудование, материалы и растворы:
флуоресцентный свет или свет дневной лампы для роста ряски (полное освещение в течение 16 ч); стерильная культура растений ряски; 21 чистый пластиковый контейнер; среда для культивирования — ростовой раствор (табл. 23.1); пипетка для добавления ростового раствора; пинцет для отлова ряски; чистая пластиковая пленка или пластиковая пластинка; 100 мл тестируемого раствора в концентрации 4 ПДК (табл.

23.2); дистиллированная вода для контрольного варианта.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
В тестировании использовали 5-дневный цикл развития растений. Подготовить посуду для контроля и с указанными концентрациями испытуемого вещества. Налить 30 мл раствора в каждый контейнер. В контрольный вариант влить родниковую или отстоянную водопроводную воду и добавить одну каплю раствора для культивирования. Используя пинцет, перенести в каждый контейнер по 5 растений рясок. Выбирать только зеленые, здоровые растения с 2 дочерними листецами и приблизительно одинаковых размеров. Закрыть контейнеры пленкой и поместить на 24 ч под лампу дневного света. Размещения контейнеров под прямыми солнечными лучами у окна следует избегать, чтобы предотвратить перегрев и усыхание листецов (они сжимаются, теряют тургор).
Таблица 23.1
Состав среды для культивирования ряски

Макроэлементы, мг/л
KN03	350,00
Ca(N03)2 • 4Н20	295,00
КН2Р04	90,00
к2нро4	12,60
MgS04- 7Н20	100,00
Микроэлементы, мкг/л
н3во3	120,00
ZnS04- 7Н20	180,00
Na2Mo04 ¦ 2Н20	44,00
МпС12 • 4Н20	180,00
FeCl3 • 6Н20	760,00
Трилон Б*	1500,00

Контейнер с листецами оставить еще на 5 дней. Его следует прикрыть только пластиковой пластиной, чтобы не допустить попадания воды в течение всего периода тестирования. В конце пятого дня подсчитать количество листецов в каждом контейнере. Сложность подсчета может быть связана с малыми размерами листецов ряски малой, однако в этом случае можно воспользоваться лупой. Записать данные учета роста тест-объекта в табл. 23.2 и сделать пометки, какие растения изменили цвет, зафиксировать наличие или отсутствие корней и описать общий вид растений. Провести стандартную статистическую обработку и анализ полученных результатов. Первый шаг — проверка контрольного варианта с целью выявления фонового роста ряски в незагрязненных условиях. Если растения ряски в контрольном варианте не выросли или выглядят не совсем здоровыми, то результаты эксперимента аннулируются. Возможно, питательный раствор был слишком сильный или растения были не здоровы в самом начале эксперимента; также возможны проблемы с окружающей средой во время тестирования. Для оценки воздействия загрязнителя существует показатель мгновенного отклика популяции — коэффициент роста (/•), изменение которого отражает сопротивление среды, т. е. характеризует сумму всех лимитирующих факторов среды, препятствующих реализации репродуктивного потенциала (/-гаах), который рассчиты-




конечная численность листецов; t — время экспозиции (сутки). Данные записываются в таблицу учета роста тест-объекта.
Внимание! Значение описания всевозможных изменений, происходящих с тест-объектом, очень важно. Также полезно смотреть на отдельные растения, чтобы понять особенности реакции тестируемого организма. Важно отметить, как растения реагируют в начале эксперимента, что с ними происходит потом, идет ли реакция по отдельным растениям либо реагирует вся группа. Все эти особенности внести в табл. 23.2. В табл. 23.3 представлены некоторые формы реакции ряски малой на присутствие в воде солей тяжелых металлов. Провести оценку токсичности среды по следующим критериям:
LC5o — летальная концентрация, которая убивает 50% тест- организмов;
ТС — treshold concentration — минимальная, или пороговая, концентрация, обеспечивающая рост не более 50 % организмов.
В биотестировании по рясковому тесту растения продолжают расти, в связи с чем чаще всего используется показатель ТС50.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Перечень основных терминов и понятий
Колония — сообщество материнских и дочерних листецов, соединенных друг с другом.
Листец — одиночное растение в колонии рясок. Это маленькая пластинка, которая соединила в себе лист и стебель, способная к размножению.
Маточная культура — растения одного вида рясок.
Питательный раствор — раствор, содержащий питательные вещества и микроэлементы для роста ряски.
Посевная культура — число листецов, добавленных в тестируемую среду в начале биотестирования.
Предшествующая культура — культура рясок, используемая для акклиматизации тестируемых растений в условиях эксперимента.
Прирост — увеличение биомассы за определенный промежуток времени; оценивается подсчетом численности листецов.

Среда для культивирования — раствор питательных веществ в отстоянной водопроводной воде для обеспечения роста ряски, а также для разбавления исследуемых вод.
Тестируемый образец — получают из анализируемой природной воды, сточных вод и растворов загрязняющих веществ посредством различных приготовлений, таких как разбавление, фильтрация, нейтрализация.
Тестируемый раствор — это комбинация из тестируемого образца, дистиллированной воды и питательного раствора.
Хлороз листеца — пожелтение или полное обесцвечивание ли- стеца в результате потери пигмента.
Чистая культура — культура растений ряски, свободная от других организмов (других видов рясок, водорослей или водных животных).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Евгеньев М. И. Тест-методы и экология // Соросовский образовательный журнал, 1999. — №11.
Методика определения токсичности воды и водных вьггяжек из почвы, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафнии. — Федеральный реестр ФР. 1. 39.2001.00283. — Жмур Н. С. — М.: Акварос, 2001.
Цаценко Л. В. Рясковые — биоиндикаторы агроценоза / Л. В. Цаценко, Н. Г. Малюга. — Краснодар: КубГАУ, 2000.
Цаценко Л. В. Методика биотестирования почвы на основе ряскового теста в агроэкологическом мониторинге / Л. В. Цаценко, Н. Г. Малюга. — Краснодар: КубГАУ, 2003.
AFNOR 1996 Determination of the inhibitory effect on the growth of Lemna minor XP T 90-337.
Environment Canada 1998 Biological test method: test for measuring the inhibition of growth using the freshwater macrophyte Lemna minor Report EPS l/RM/37.
EPA 1996 Ecological effects test Guidelines OPPTS 850.4400 Aquatic plant toxicity test using Lemna ssp., Tiers I and И, ЕРА 712-C-96 —156.
OECD 1998 Draft OECD test guideline — Lemna growth inhibition test.
SIS 1995 Swedish Institute of Standards, Water quality — determination of growth inhibition(7-d) Lemna minor, duckweeds SS 02 82 13. 

Еще по теме Лабораторная работа № 23. БИОТЕСТИРОВАНИЕЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ С ПОМОЩЬЮ РЯСКИ МАЛОЙ(iLEMNA MINOR L.) (Методика разработана Л. В. Цаценко):

1. 4.6. Методики, разработанные А. В. Крушинским для изучения способности животных к поиску приманки, исчезающей из поля зрения
2. 6.2. Исследование способности животных к символизации (на примере «счета») с помощью лабораторных тестов
3. Индский дельфин Platanista minor Owen, 1853 (= P. indi Blyth, 1859*) (III, 241)
4.   Количественное определение афлатоксинов В( и G( в кормах. Метод разработан Н. А. Соболевой.  
5. Использование разработанных подходов и методовдля экологической оценки микробныхсообществ наземных экосистем
6. 3 ГИГИЕНА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
7. СВЕДЕНИЯ О ГЕЛЬМИНТОЗАХ ЛАБОРАТОРНЫХ ГРЫЗУНОВ
8. Организация оплодотворения самок в лабораторных условиях
9. Лабораторно-полевые ульи для шмелей
10. Методика гальванизации.
11.   ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АППАРАТУРЫ В ЛАБОРАТОРНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ  
12. методика экспериментальных исследований АГРЕГАЦИИ ПОЧВЕННЫХ ЧАСТИЦ
13. Глава II МЕТОДИКА
14.   ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ ТЕСТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВНУТРЕННИХ БОЛЕЗНЕЙ 
15. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
16. АДЕНОВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ ОБЕЗЬЯН И ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ