НОВЫЕ ДАННЫЕ О МЕХАНИЗМЕ ФИКСАЦИИ АТМОСФЕРНОГО АЗОТА В КЛУБЕНЬКАХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ [31]

Механизм фиксации атмосферного азота в клубеньках бобовых растений до последнего времени оставался неясным.

Бесспорным является то положение, что клубеньковые бактерии Rhizobium не могут фиксировать молекулярный азот, разви- /ваясь вне высшего растения и что этот процесс осуществим только в симбиозе бактерий с высшим растением.

В опытах Зилитча, Вильсона и Бэрриса [8] и Эйприсона, Мэги и Бэрриса [3] при помещении клубеньков сои в атмосферу меченого азота сразу же после отделения их- от растения фиксация азота происходила' во всех случаях, .хотя интенсивность ее была не высокой. Следовательно, изоляция клубеньков от всего растения, даже в пределах очень коротких промежутков времени, резко ограничивает интенсивность фиксации азота. Это очень хорошо 'видно из данных, приведенных в работе Бонда [4]. Этот исследователь помещал целые молодые растения ольхи Alnus glutinosa и изолированные ее клубеньки ib атмосферу, обогащенную изотопом N15, и нашел, что содержание меченого азота в изолированных клубеньках было в несколько раз ниже, чем в не изолированных от растений клубеньках.

Таким образом, изучение фиксации молекулярного азота при функционировании всей .симбиотической системы в целом и при одновременном использовании метода изолированных клубеньков может представить более широкие возможности для дальнейшего прогресса в познании механизма этого процесса, чем использование для этих целей только изолированных клубеньков.

Главной целью исследований, основные результаты которых изложены в настоящей работе, являлось выяснение следующих вопросов.

1. Точная локализация процесса фиксации атмосферного азота. Развитие изотопного метода за последние гады позволило установить, (что этот процесс осуществляется в клубеньках. Но клубеньки бобовых представляют сложную систему, включающую гипертрофированную ткань высшего растения и бактериальные тела. Хотя и принято считать, что фиксацию молекулярного азота ib клубеньках осуществляют бактерии Rhizobium, но точных данных, подтверждающих это положение, не было получено. 2. Химическая природа первичных продуктов симбиотиче

   ской фиксации азота. 3. Интенсивность фиксации и скорость оттока фиксируемого азота из клубеньков в другие органы растений. 4. Фиксация азота в клубеньках бобовых растений и углеводный баланс.

Исследования большей частью проводили с растущими растениями и ,в меньшей мере с изолированными от растений клубеньками. В качестве подопытных растений использовали люцерну, горох, красный клшар и желтый люпин, которые выращивали в условиях вегетационных опытов в сосудах размером 20X20 или 17X30 ом.

Перед посевом семена ино,купировали чистой культурой высокоактивного штамма клубеньковых бактерий, вызвавших впоследствии интенсивное образование клубеньков на корнях растений.

В почву (известкованная подзолистая суглинистая Долгопрудной агрохимической опытной станции) при закладке опытов вносили в оптимальных дозах фосфорные и калийные удобрения, а также микроэлементы — бор и молибден.

В период наиболее интенсивной фиксации атмосферного азота (о чем можно было судить по резкому усилению прироста массы растений и по интенсивности их зеленой окраски) сосуд с растениями помещали в специально оборудованную, герметически закрывающуюся стеклянную камеру емкостью в 33,1 л, снабженную необходимыми приспособлениями для впуска и выхода воздуха. Из камеры после проверки ее герметичности откачивали от 8 до 10 л воздуха, затем ее выходное отверстие закрывали и в камеру из газометра вводили последовательно 1,5 л С02[32] и 6,5—8,5 л газообразного азота, обогащенного изотопом N15.

Продолжительность экопозиции растений в камере с N215 варьировала по условиям опыта от 12 до 90 часов. По истечении заданного срока экспозиции растения немедленно снимали и подвергали последова.нию. Листья, стебли и корни растений после взвешивания растирали в стеклянной ступке и затем экстрагировали водой. Водные экстракты подвергали нагреванию на кипящей водяной бане. В этих условиях происходила полная коагуляция белков, которые затем отфильтровывали и исследовали отдельно от фильтрата, содержащего только небелковые соединения азота. Выделенные из растений фракции анализировали на содержание азота по Кьельдалю и его изотопный состав на масс-спектрометре МС-2.

Метод исследования клубеньков должен был обеспечить полное отделение бактерий Rhizobium от клеточного сока и форменных элементов клубеньковой ткани. Было найдено, что при легком раздавливании оплавленной стеклянной палочкой клубеньков в фарфоровой чашке с водой бактерии практически полностью можно отделить от форменных элементов клубеньковой ткани путем фильтрования раздавленных под водой клубеньков через слабый бумажный фильтр. Клубеньковая ткань остается на фильтре, а бактерии вместе с разбавленным в воде клеточным соком клубеньков проходят в фильтрат. Последний повторно фильтруют через бактериальный фильтрат — свечу Чемберлена— с применением разрежения для ускорения фильтрования. Бактерии полностью остаются на фильтре, а раствор клеточного сока переходит в фильтрат. Отфильтрованную бактериальную массу промывают на это'м же фильтре дистиллированной водой и затем снимают с фильтра при помощи стеклянной палочки с насаженным на ее конец кусочком каучука. Микроскопическое исследование выделяемой таким путем бактериальной массы (показало, что она авободна от каких-либо посторонних включений.

В последнее время для отделения бактерий от клеточного сока в нашей лаборатории применяют супер-цснтрифугу с 20 ООО оборотов в минуту при ускорении в 12 000 g. При двукратном центрифугировании в течение 15—20 минут взвеси бактерий в разбавленном водой клеточном соке бактерии практически полностью осаждаются на стенках ротора центрифуги. Результаты анализа клубеньковых бактерий люцерны, клеточного сока клубеньков и клубеньковой ткани, отмытой от бактерий и клеточного сока, представлены в таблице 1.

Таблица 1

Химический состав клубеньковых бактерий люцерны (Rhizobium mililoti) клеточного сока клубеньков и клубеньковой ткани (мезга), % на сухой вес

Судя по содержанию азота, около 55% всей массы бактерий приходится на белковые вещества. Характерным для бактерий является сравнительно высокое Содержание железа. Интересно, что молибден, которому придается важная роль в фиксации

азота клубеньками, в основной массе локализован в клеточном соке клубеньковой ткани, в бактериях же его содержится примерно в 10 раз меньше, чем в клеточном соке.

Выделенные из клубеньков бактерии, равно как и другие компоненты клубенька, подвергли анализу «а содержание общего азота и его изотопный состав (табл. 2).              •              ,

Таблица 2

Меченый азот в клубеньковых бактериях (Rhizobium), в клеточном соке клубеньков и в белке клубеньковой ткани бобовых растений

* Обогащение азота атмосферы изотоиой N15 в опыте 1 было 0,81 атом% избытка N15; в опыте 9 — 0,72 атом% избытка N15; во всех остальных опытах оно было равным il,14 атом% избытка N15.

При наиболее короткой в этих опытах экспозиции гороха и люцерны в атмосфере N215 (12 часов) меченый азот был обнаружен в весьма значительных количествах в составе водорастворимой фракции клубеньков и совершенно отсутствовал в бактериях. Крайне низкое обогащение изотопом N15, стоящее на грани точности опыта, было обнаружено для азота бактерий и при экспозиции люцерны в атмосфере меченого азота в' течение 24 часов. При более длительных экспозициях содержание меченого азота в бактериях несколько повышается, но его нельзя сравнить с весьма высокой величиной для водорастворимой азотистой фракции клеточного сока клубеньков. Содержание меченого азота в белках отмытой клубеньковой ткани незначительно, но в среднем несколько выше, чем в бактериях.

Результаты этих опытов дают неоспоримые доказательства того положения, что фиксация атмосферного азота в клубеньках бобовых осуществляется не в бактериях, а в клетках клубеньковой ткани, представляющей перерожденную ткань высшего

растения. Вероятно, бактерии выделяют какое-то -вещество, под воздействием которого образуется на корнях бобовых специфическая клубеньковая ткань, обладающая соответствующей ферментной системой, при участии которой и осуществляется фиксация молекулярного азота атмосферы. Сами же по себе бактерии не могут фиксировать молекулярный азот. До сих пор никому не удавалось наблюдать фиксацию азота в чистых культурах. И если у некоторых исследователей как будто бы и происходила фиксация азота изолированными' от растений бактериями, то в этом повинны только случайные загрязнения или недостаточная точность аналитических методов. В первые часы экспозиции бобовых растений в атмосфере, обогащенной N15, меченый азот может быть обнаружен только в составе водорастворимых небелковых азотистых соединений клеточного сока клубеньков.

Для установления химической природы первых продуктов симбиотической фиксации азота необходимо было определить, в составе каких именно соединений впервые появляется меченый азот. По данным количественного хроматографического анализа, около 50°/о всего водорастворимого азота клеточного сока люцерны представлено аспарагином [1]. Согласно данным, полученным в нашей лаборатории 3. Н. Берсеневой и В. М. Макаревич, в весьма больших количествах (от 25 до 60%) аспарагин содержится и в клубеньках клевера, гороха, люпина. По данным Сен и Бурма [7], в больших количествах аспарагин представлен также в составе клеточного сока клубеньков бобовых, возделываемых в условиях Индии: чечевица — Lenz esculenta; чина — Lathiyrus , sativus, нут — Cicer arietinum; горох — Pisum sativum. Кроме аспарагина, в состав клеточного сока входят различные аминокислоты.

Для выделения аспарагина и отдельных аминокислот был использован метод многослойной восходящей или круговой ‘хроматограммы. Идентификацию отдельных аминокислот производили нингидринной реакцией на нескольких листах многослойной хроматограммы. По этим проявленным листам устанавливали локализацию аминокислот на необработанных нингидри- ном листах хроматограммы. Участки бумаги с локализованными на них аминокислотами вырезали, аминокислоты из этих участков выщелачивали дистиллированной водой и подвергали повторной хроматографической очистке. В процессе очистки отдельных аминокислот происходили значительные их потери, поэтому абсолютный выход большинства индивидуальных аминокислот был мал, кроме аспарагина, содержащегося в исходном материале в весьма больших количествах. Чтобы иметь достаточные количества исследуемого материала, обеспечивающие высокую точность эксперимента, оказалось необходимым выделять отдельно только аспарагин, а все индивидуальные аминокислоты объединить в две группы— дикарбоновые амино

кислоты (сумма глутаминовой и аспарагиновой кислот) и сумму всех прочих аминокислот.

Результаты изотопного анализа этих трех фракций клеточного оока клубеньков бобовых растений при экспозиции их в атмосфере меченого азота в течение 24 часов приведены в таблице 3.

Таблица 3

Распределение меченого азота между аспарагином и другими аминокислотами, выделенными из клеточного сока клубеньков бобовых растений

Наиболее высокое обогащение изотопом N15 в этих опытах было обнаружено для аюпарагина. В дикарбоновых аминокислотах и в смеси прочих аминокислот содержание меченого азота было в несколько раз меньше, чем в аспарагине.

Результаты этих опыто/в не совпадают с данными, полученными в опыте Эфприюона, Мэги и Бэрриса [3], в котором при изучении фиксации азота на изолированных клубеньках наиболее высокое обогащение изотопом N15 отмечено для глутаминовой кислоты и значительно меньше оно было для аспарагина. Возможно, что такой результат в опыте Эфприсона и сотр. и является артефактом, так как в его опытах клубеньки предварительно были растерты, в 3 н. НС1, в результате чего должно было происходить омыление аспарагина.

В ряде наших других опытов с люцерной, клевером и горохом были получены совершенно однотипные данные, показывающие, что фиксируемый в клубеньках бобовых азот используется в первую очередь на синтез именно аспарагина, а не дикарбоновых или каких-либо других аминокислот. При этом в составе самого аспарагина меченый азот в максимальном количестве обнаруживается в амидной группе. Это видно из данных таблицы 4.

Таким образом, содержание меченого азота в легкоомыляемой амидной фракции клеточного сока в этих опытах было в 3—7 раз больше, чем во всех других азотистых фракциях клеточного оока клубеньков люцерны. Так как аспарагин образуется в растениях в результате взаимодействия аммиака с аспарагиновой кислотой, а амидный азот аспарагина представляет

Содержание меченого азота в легкоомыляемой амидной и неомыляемой аминной фракциях клеточного сока клубеньков бобовых растений

не что иное, как трансформированный аммиак, то только аммиак и является одним из первичных, если не самым первым продуктом биологической фиксации азота «атмосферы в клубеньках бобовых.

Таблица 5

Изменения в содержании меченого азота в отдельных фракциях клеточного сока клубеньков бобовых растений при смене атмосферы N ?gt;5

• на обычную атмосферу

Содержание меченого азота, % к общему азоту фракции

Условия опыта

Фиксированный в клубеньках азот непрерывно отводится в другие органы растения. Скорость этого перемещения весьма значительна. В таблице 5 приведены результаты опытов, в которых определяли содержание меченого азота в отдельных фракциях клеточного сока клубеньков люцерны и клевера при экспо-

зиции этлх растений сначала в атмосфере N15 и затем через 24 «и через 48 часов после смены меченой по N15 атмосферы на обычную нормальную атмосферу.

Уже через 24 часа после замены меченой атмосферы на нормальную содержание меченого азота в клеточном соке клубеньков резко упало. Это падение в первую очередь происходило за счет амидной фракции, в которой содержание меченого азота упало в 4—5 раз, в то время как в аминной фракции оно снизилось всего лишь в 1,5—2 раза. Это вполне понятно, так как в данном случае фиксированный обычный азот прежде всего включается © состав амидной группы, и, следовательно, ранее фиксированный в этой группе меченый азот при последующей смене атмосферы быстрее замещался на обычный азот.

Более полное представление об интенсивности процесса фиксации молекулярного азота в клубеньках и о скорости включения вновь фиксируемого азота в состав азотистых веществ отдельных органов бобовых растений могут дать результаты опыта с горохом, приведенные в таблице 6.

При относительно кратковременной экспозиции (24 часа) меченый азот в наибольшем количестве обнаружен в водорастворимой фракции клубеньков, т. е. в их клеточном соке; это подтверждает факт, что фиксация азота локализуется именно в этой фракции клубеньков. Фиксированный здесь азот, как это можно судить по степени обогащения изотопом N15 отдельных азотистых фракций растений, отводится через непосредственно прилегающие к клубенькам корни сначала в стебли, а затем в листья растений.

Вновь фиксированный в клубеньках азот в первые 24 часа остается в растении в основной своей массе в форме небелковых соединений (амиды и аминокислоты). Но уже через 72 часа фиксированный меченый азот был обнаружен в белках, в наибольшем количестве в стеблях и в меньшем — в корнях и листьях. Всего же при общей массе растений около 180 г в течение трех суток было фиксировано 122 мг азота, а в сутки в среднем фиксируется около 40 мг азота. Примерно такие же результаты были получены в опытах с люцерной, люпином и клевером.

Так как фиксация атмосферного азота осуществляется в клубеньковой ткани высшего растения, то всякое изменение ее интенсивности обусловливается прежде всего состоянием высшего растения. Очевидно, активность клубеньковой ткани как азотфиксирующей системы зависит от притока к ней каких-то веществ, продуцируемых в других органах высшего растения. При неблагоприятных для роста растений условиях среды или при старении растений в них продуцируется меньше этих веществ и соответственно падает каталитическая активность клубеньковой ткани.

Такое заключение вытекает также из опытов по изучению влияния условий освещения на симбиотическую фиксацию азота

Содержание общего и меченого азота в небелковых и белковых фракциях отдельных органов гороха

Экспозиция 24 часа, атом% избытка N15 в атмосфере — 1,15

Экспозиция 72 часа, атом% избытка N15 в атмосфере'—1,03

Клубеньки

Корни

Корни

Стебли

Листья

Итого

Корни и их части, непосредственно прилегающие к клубенькам. Корни, более отдаленные от клубеньков.

в люпине, схема и ориентации которого приведены в таблице 7.

Эти опыты проводили © одно и то же время в •вегетационном: павильоне. Для затемнения растений на стеклянные камеры, в которые их помещали, навешивали чарную хлопчатобумажную ткань. При нормальном освещении люпина происходила интенсивная фиксация азота, но она резко падала и практически совершенно прекращалась, когда растения как во время опыта, так и в течение 48 часов до начала опыта оставались без света.

Из результатов этих опытов .следует, что свет необходим для образования в растениях веществ, при наличии которых только и /возможна фиксация азота в клубеньковой ткани. Какова природа этих веществ, неизвестно, но речь может идти не только об углеводам. Во всех частях растений, даже в наихудшем ва-

Влияние условий освещения на фиксацию атмосферного азота в клубеньках люпина при экспозиции его в атмосфере, обогащенной N \5 в течение 48 часов

рианте при затемнении в течение 96 чаюов (48 часов во время опыта и 48 часов до опыта) к концу опыта оставалось еще весьма значительное количество углеводов (сумма моно- и дисахаридов); поэтому они не могли в данном .случае лимитировать фиксацию. Следовательно, фиксацию ,азот а в данном случае осуществляет какое-то другое вещество, синтезированное в растении только на свету. Постоянный приток этого вещества, которое ,мы для удобства обозначим как фактор А, в клубенек является непременным условием для осуществления процесса фиксации молекулярного азота в его ткани.

В изолированных от растений клубеньках фиксация азота может происходить в течение весьма ограниченного времени и только до тех пор, пока не будут израсходованы эти вещества (фактор А), поступившие ранее в клубенек из листьев высшего растения. Это подтверждено следующими данными таблицы 8.

В свежеотделенных от растений клубеньках фиксация азота, как это можно судить по содержанию в них изотопа N15, резко падала, а в клубеньках, отделенных от растений за 24 часа до начала опыта, содержание меченого азота было столь .низким, что оно немногим превышало возможную ошибку при изотопном (анализе. Абсолютное отсутствие меченого азота в свежеотделенных от растения, но измельченных клубеньках показывает, что фиксация молекулярного азота в клубеньковой ткани сопря-

Содержание меченого азота в амидной группе, выделенной из клеточного сока изолированных и не изолированных от растения клубеньков люцерны

жена с определенной ее -структурой. Разрушение этой структуры исключает возможность осуществления фиксации азота.

Интенсивность фиксации азота в изолированных клубеньках, по-видимому, не лимитировалось недостатком ,углеводов. Проведенные исследования показали, что содержание суммы моно- и дисахаридов в немедленно отделенных от растений клубеньках (в этих опытах составляло 2,67% сырого веса клубеныков. После 24-часовой экспозиции клубеньков в атмосфере меченого азота или в нормальной атмосфере влажной камеры содержание растворимых углеводов в клубеньках по понятным причинам уменьшилось и составляло в среднем из ряда опытов около 1,7% на сырой вес клубеньков. Это все же весьма значительная величина, поэтому не может быть речи о каком-либо недостатке углеводов для нормальной фиксации азота в клубеньке. Безусловно, что кроме углеводов, из листьев растений поступают в клубенек, какие-то другие вещества, наличие которых является обязательным для осуществления фиксации молекулярного азота на структурных элементах клубеньковой ткани.

Итоги проведенных исследований по изучению фиксации молекулярного азота в клубеньках бобовых растений могут быть выражены в виде следующей схемы (см. рис. 1).

Бактерии Rhizobium, проникая в корни бобовых растений, выделяют вещество (фактор Б), индуцирующее образование клубеньковой ткани, на поверхности которой и происходит фиксация атмосферного азота. Но этот процесс осуществим только в том случае, если клубеньковая ткань снабжается некоторым специфическим веществом (фактор А), синтезируемым на свету

Общая схема процесса фиксации атмосферного азота в клубеньках бобовых растений.

в листьях бобовых растений. Первым продуктом фиксации является аммиак, который быстро трансформируется в амидную группу аспарагина. Последний, являясь 'транспортной формой аммиака в растении, используется в синтезе аминокислот, которые в дальнейшем идут на построение белка как высшего растения, так и сожительствующих с ним бактерий.