Биологическая фиксация азота

Проблема азотного баланса почв и азотного питания растений — одна из центральных в почвоведении и агрохимии. От ее правильного решения зависит продуктивность и сохранение почвенного плодородия при многолетней эксплуатации земель и сохранение биосферы.

В естественных экосистемах растения используют азот из разных источников: из минеральных форм, из органических веществ в том числе и гумуса после его разложения микроорганизмами и от бактерий азотфиксаторов, связывающих молекулярный азот, который в форме аммония и аминокислот поступает в клетки корня. В агроценозах растения дополнительно получают азот из вносимых в почву минеральных и органических удобрений. Азот, включенный в биомассу растений в результате фиксации его бактериями, называют биологическим, а сами бактерии, связывающие молекулярный азот, — азотфиксаторами, или диазотрофами. Доля биологического азота в урожае по разным оценкам колеблется от 20 до 90%. Очень много биологического азота могут получать бобовые растения за счет симбиоза с клубеньковыми бактериями азотфиксаторами. Микробное связывание молекулярного азота — единственный путь снабжения растений азотом, не ведущий к нарушению экологической среды. Обратный эффект дает применение минеральных азотных удобрений.

Суммарная годовая продукция азотфиксации в экосистемах на Земле не известна, но, вероятно, она очень велика. В сельскохозяйственные угодья вносится 30% связанного азота в виде минеральных азотных удобрений. В основе производства удобрений лежит способ, разработанный в Германии и получивший название метода Габера-Боша. Он заключается в синтезе аммиака из молекулярного азота и водорода на катализаторах при высокой температуре и давлении.

В молекуле азота существует очень прочная тройная связь, которая обеспечивает инертность газообразного азота. Для перевода одной молекулы N2b две молекулы аммиака требуется 225 ккал:

Биологический процесс восстановления азота представляет собой цепь ферментативных реакций, в которых главную роль играет фермент нитрогеназа. Активный центр этого фермента состоит из комплекса двух белков, содержащих железо, серу и молибден в соотношении Fe:S:Mo = 6:8: 1. Выделена также ванадийсодержашая нитрогеназа, уровень активности которой на

alt="" />30% ниже, чем у Мо-нит- рогеназы.

Азот, растворенный в воде, поступает в азотфик- сирующий центр, где в его активации участвуют два атома молибдена. После взаимодействия с азотом молибден восстанавливается за счет электронов, поступающих в активный центр через Fe-белок и Mo-Fe-белок. Этот перенос сопряжен с реакцией разложения АТФ, т.е. он идет с затратой энергии. В передаче электронов нитрогеназе участвует железосодержащий водорастворимый белок — фермент ферредок- син, а в активации водорода воды и переносе протонов — фермент гидрогеназа (рис. 79). Реакции, происходящие при работе нитрогеназы, представлены на рис. 80.

Образование нитрогеназы у бактерий связано с наличием особых nif-генов, содержащихся или в ядерной ДНК или в плазмиде, ответственной за синтез этих специфических ферментных

белков. Гены диазотрофности высоко консервативны и широко распространены у бактерий благодаря существованию эффективных систем обмена генетической информацией. В то же время диазотрофы не встречаются среди эукариот. Долгое время не обнаруживали азотфиксаторов и среди архебактерий. Однако в последнее время стало известно, что метаногены имеют особую термостабильную ферментную систему азотфиксации, отличную от термолабильной системы эубактерий.

Рис. 80. Строение нитрогеназы и ее участие в трансформации различных соединений

У бактерий-азотфиксаторов встречаются все известные типы метаболизма. Среди них есть аэробы с дыхательным энергетическим обменом, анаэробы, осуществляющие брожение, хемо- органотрофы, автотрофы-фотосинтетики и хемолитоавтотрофы. Фиксация молекулярного азота для них не обязательный процесс, так как в присутствии азота в другой форме — минеральной или органической — они обеспечивают свои потребности связанным азотом.

Большое значение для активной азотфиксации имеет концентрация кислорода, так как фермент нитрогеназа подавляется молекулярным кислородом. У разных микроорганизмов выработались различные механизмы защиты нитрогеназного комплекса от кислорода.

У аэробных бактерий-диазотрофов (например, азотобактера) происходит активное связывание кислорода за счет повышения уровня дыхания при азотфиксации. Для быстрого расхода кислорода часть органических молекул сжигается клеткой «непроизводительно», т.е. путем окисления без запасания энергии. Другой механизм зашиты нитрогеназы в аэробных условиях — конформа- ционное изменение тех компонентов ферментных белков, которые чувствительны к кислороду, а также связывание последних в стабильные комплексы с помощью специальных FeS-белков.

У цианобактерий, выделяющих кислород внутриклеточно при фотосинтезе, процесс азотфиксации перемещен в нефотосинтезирующие гетероцисты, где он пространственно изолирован от кислорода. Симбиотические клубеньковые бактерии защищены тканью клубенька и, кроме того, у них имеется леггемоглобин, который транспортирует необходимый для дыхания кислород непосредственно к бактероидам в менее активном связанном виде.

Азотфиксирующие бактерии по их связи с растениями делят на свободноживущие и симбиотические.

Симбиоз контролируется комплексом соответствующих комплементарных генов растения и бактерии.

Исследования показали, что некоторые бактерии не фиксируют азот. Вероятно не удалось подобрать условия для осуществления этого процесса. На протяжении 70 лет не удавалось установить азотфиксацию у чистых культур клубеньковых бактерий, так как не были подобраны подходящие условия. Достаточно было понизить парциальное давление кислорода и они начали фиксировать азот.

Так называемые свободноживущие азотфиксаторы распространены повсеместно и встречаются среди бактерий самых разных таксономических групп, относящихся как к хемотрофам, так и фототрофам, к аэробам и анаэробам. Первый диазотрофный микроорганизм был обнаружен в конце XIX в. (1898 г.) С.Н. Виноградским среди анаэробных маслянокислых бактерий рода Clostridium. Он назвал его в честь Пастера Clostridium pasteurianum. Вскоре (1901 г.) М. Бейеринком в Голландии был выделен аэробный азотфиксатор, получивший за свою морфологию и цвет (кокковидные бактерии, колонии которых с возрастом темнеют до шоколадного цвета) название Azotobacter chroococcum. Впоследствии способность к связыванию молекулярного азота была установлена у огромного числа почвенных бактерий, в том числе и у цианобактерий (прежнее название — синезеленые водоросли).

В благоприятных условиях, например на затопляемых почвах рисовников, прибавка азота за счет деятельности цианобактерий может достигать 25-50 кг/га в год. В зональных автоморфных почвах и в агроценозах их вклад в общее азотонакопление не превышает нескольких килограммов азота в год на 1 га.

Суммарная годовая потенциальная продукция азота свобод- ноживущими азотфиксаторами (в условиях лабораторных экспериментов с внесением источников углерода) для разных почв разная и колеблется от десятков до сотен килограммов на гектар (кг/га в год): дерново-подзолистые 30-200; серые лесные 50-200; черноземы и черноземно-луговые 90-300; каштановые 100-300; сероземы 100-400.

Ассоциативной азотфиксацией называют накопление азота микроорганизмами, живущими в ассоциации с первичными продуцентами органического вещества — растениями, водорослями или цианобактериями. Эффект высокой нитрогеназной активности в этих ассоциациях связан с поступлением к бактериям от фототрофов легкодоступных источников углерода и энергии в виде экссудатов листьев и корней, внеклеточных слизей цианобактерий, корневого отпада и опада.

Влияние растений на азотонакопление в прикорневой зоне небобовых растений было отмечено еще в 1926 г. академиком

С.П. Костычевым на примере табака и азотобактера. Процесс ассоциативной азотфиксации тесно сопряжен с фотосинтезом. Он протекает не только в корневой зоне, но и филлосфере, причем на долю последней приходится 10% фиксированного азота. Связующим звеном между фотосинтезом и азотфиксацией служат прижизненные выделения корнями органических веществ. Это могут быть сахара и органические кислоты, полисахаридные слизи (муцигель) и другие экссудаты.

Общее количество органических соединений, выделяемых корнями, может составлять до 30-40% от суммарной продукции фотосинтеза за вегетационный период, что было установлено, когда растению давали меченую С02. Исходя из этого расчета следует оценивать ассоциативную азотфиксацию примерно в 10-25 кг N2 на 1 га в год для почв средней полосы и до 50-100 кг — в субтропической и тропической зонах, однако пока такие расчеты остаются очень неточными. В длительных опытах, проведенных в нашей стране и за рубежом, было показано, что потери азота из почвы, в которую азотные удобрения не вносили, минимальны даже в случае монокультур небобовых растений по сравнению с почвами бессменного пара.

Поступающие в почву через корни органические вещества активизируют деятельность не только диазотрофов, но и микроорганизмов, разлагающих гумус. Таким образом, мобилизация азота в системе «почва-микроорганизмы-растение» происходит по двум каналам — связывание его из атмосферы и извлечение из органических веществ почвы. Включение того или иного процесса и их эффективность определяются наличием в почве легкодоступного азота. При внесении азотных удобрений микроорганизмы переходят от азотфиксации к связыванию (иммобилизации) растворимых форм азота с частичными потерями N2 в атмосферу за счет денитрификации. По мере увеличения соотношения углерода и азота в среде активизируется процесс азотфиксации, а усиление фотосинтетической деятельности растений приводит к возрастанию степени минерализации гумуса.

Вскрытие механизмов работы живой системы почвы приводит к пониманию путей управления этой системой. Применение сбалансированных доз азотных удобрений, повышая фотосинтети- ческую активность растения, косвенно способствует усилению азотфиксации и увеличивает долю биологического азота в урожае.

Ассоциативные микробы-диазотрофы есть и у животных. Доказана способность к азотфиксации у бактерий кишечной группы рода Escherichia, обитающих в качестве комменсалов в пищеварительном тракте человека. Азотфиксаторы обитают в пищеварительном тракте всех позвоночных и беспозвоночных животных. Сколько они фиксируют азота в реальных условиях, остается неизвестным. Эта область исследований еще мало разработана, и микробные ассоциации во многих случаях плохо идентифицированы. Особый интерес вызывают животные, питающиеся кормом, содержащим мало азота (жвачные, грызуны, термиты).

Симбиотическая азотфиксация — важнейший резерв биологического азота в почве. Микробные азотфиксирующие симбионты описаны у многих видов разных растений. Проникая в ткани растения, они вызывают опухолевидные разрастания в форме клубеньков на корнях или стеблях.

Наиболее активные и хорошо изученные диазотрофные симбионты — клубеньковые бактерии бобовых растений. Семейство бобовых содержит 674 рода и 19 тыс. видов, из которых 200 используются в сельском хозяйстве. Бобовые распространены по всему миру и по значению занимают второе место после злаков. Уникальным свойством бобовых является формирование корневых клубеньков как у культурных, так и у дикорастущих растений. Однако не все бобовые образуют клубеньки, большинство видов даже не исследовано в этом отношении.

Образование клубеньков и последующее развитие азотфикси- рующего симбиоза у бобовых происходит в ответ на инфицирование бактериями нескольких родов, относящихся к семейству Rhizobiaceae. В природе и в сельском хозяйстве эти симбиозы играют важную роль как поставщики связанного азота. Не все представители семейства Rhizobiaceae являются полезными. Некоторые виды рода Agrobacterium вызывают болезни растений. Представители рода Phyllobacterium образуют клубеньки на листьях некоторых растений, значение которых пока не ясно.

Первым в чистую культуру бактерии из клубеньков выделил М. Бейеринк. Систематика клубеньковых бактерий первоначально строилась на названии растения хозяина, была очень проста, понятна и удобна для практического использования клубеньковых бактерий при инокуляции бобовых растений. Это были клубеньковые бактерии клевера, гороха, сои, люпина, люцерны и др. Все они относились к одному роду Rhizobium. Однако в последнее время особенно в связи с глубокими и разносторонними исследованиями нуклеиновых кислот оказалось, что это очень разнородная группа бактерий и часто резко отличающиеся бактерии образуют клубеньки на одном и том же растении и даже один вид бактерий может иметь много растений-хозяев.

В настоящее время выделяют по меньшей мере четыре рода клубеньковых бактерий: Rhizobium, например Rhizobium leguminosarum bv trifolii (клевер), bv viceae (горох), bv meliloti (люцерна). Это быстрорастущие бактерии; Sinorhizobium (вика, люцерна, соевые, у сесбании клубеньки образуются на стебле); Mezorhizobium; Bradyrhizobium, например Bradyrhizobium japonicum (соя). Это медленнорастущие бактерии.

Обозначение bv — биовариант.

Гены азотфиксации у некоторых родов располагаются на плазмиде, у других — на хромосоме.

Благодаря азотфиксирующим симбионтам бобовые обогащают почву азотом. В зависимости от условий роста растений они накапливают азот от 60 до 300 кг/га в год.

Вскоре после открытия роли клубеньковых бактерий в накоплении азота попытались использовать эти бактерии для обработки семян бобовых перед посевом. Приготовленные на основе клубеньковых бактерий препараты получили в разных странах разные названия. Изготовленный впервые в Германии в 1896 г.

препарат был назван нитрагином; в 1906 г. он был получен в Англии, в 1907 г.— в США. В Чехословакии препарат клубеньковых называли нитразоном, в Австралии — нитрофиксом. В России первые партии нитрагина были изготовлены в 1930-1935 гг.

Первый очень важный этап при изготовлении нитрагина состоит в выделении и подборе производственного штамма клубеньковых бактерий. К каждой культуре бобового растения нужно подбирать соответствующие ему штаммы: для клевера клубеньковые бактерии клевера, для гороха клубеньковые бактерии гороха, для люпина бактерии люпина. Выделяют бактерии обычно непосредственно из клубенька. Берут крупный клубенек розового цвета, окрашенный леггемоглобином, стерилизуют его поверхность сулемой или каким-либо другим антисептиком, разрезают стерильным скальпелем, извлекают небольшое количество растительной ткани и шпателем растирают ее по поверхности бобового агара в чашке Петри. Отобранный штамм должен отличаться следующими свойствами: ^специфичностью по отношению к .определенному растению, 2) генетической устойчивостью, 3) свойством доминирования, т.е. способностью быстро размножаться в почве и численно доминировать над местными малоэффективными штаммами, которые могут находиться в почве, 4) ин- вазивностью — способностью проникать в корни растений, активностью, т.е. высокой способностью к азотфиксации, 6) эффективностью — способностью повышать урожай. Он должен образовывать большие немногочисленные розовые от леггемог- лобина клубеньки. Образование большого количества мелких белых клубеньков свидетельствует о том, что этот штамм плохой. Хорошо развитые клубеньки образуют вещества, препятствующие дальнейшему клубенькообразованию. Лучшим способом, по которому можно судить о ценности штамма, является определение прибавки урожая, которую он дает. Этот метод имеет только тот недостаток, что он очень трудоемок. Если, например, испытывается сто штаммов, нужно иметь множество опытных делянок и проводить эксперименты минимум три года. Кроме того, урожай зависит от множества факторов и вычленить среди них влияние азотфиксации не так-то просто.

В России микробиологическая промышленность на основе клубеньковых бактерий выпускает препарат ризоторфин (торфяной нитрагин).

Технология производства ризоторфина заключается в следующем: выращивание жидкой культуры клубеньковых бактерии в колбе (посевной материал), 2) вырашивание бактерий в большом ферментере, в который вносится посевной материал, 3) подготовка торфа для заражения культурой (нейтрализация реакции среды, внесение питательных добавок, NPK, микроэлементов, органических веществ), раскладывание влажного торфа в полиэтиленовые пакеты, герметизация пакетов, стерилизация у-луча- ми, 4) внесение в пакет с помощью шприца клубеньковых бактерий, 5) двухнедельное подращивание бактерий в торфе при комнатной температуре с увеличением численности бактерий в 100 раз и более, 6) хранение ризоторфина в холодильнике до 6-8 месяцев. При этом титр клубеньковых бактерий не должен сильно падать.

Ризоторфин предназначен для предпосевной обработки семян зернобобовых культур и бобовых трав: гороха, люпина, сои, вики, фасоли, люцерны, клевера и др. Для каждого вида бобовых растений ризоторфин готовится отдельно из разных видов клубеньковых бактерий. Препарат представляет собой сыпучую массу с влажностью 50-100%. В 1 г препарата содержится не менее 200 млн клеток клубеньковых бактерий.

Гектарная порция ризоторфина 200 г. Предпосевная обработка семян производится путем разбавления препарата в воде и замачивания семян в день посева. При использовании ризоторфина нельзя применять ядохимикаты (фунгициды, инсектициды).

Клубеньковые бактерии почти полностью обеспечивают потребности растений в азоте. Многолетняя практика применения ризоторфина показывает, что он сильно повышает урожай сои, гороха, люцерны и клевера. При этом содержание белка в урожае существенно повышается. Наиболее высокий хозяйственный эффект ризоторфин дает лишь при соблюдении прогрессивной технологии возделывания бобовых культур. Высев обработанных ризоторфином семян необходимо производить во влажную почву, удобренную фосфором, калием и микроэлементами, особенно молибденом. На почвах слабоокультуренных, бедных азотом, применение ризоторфина следует сочетать с внесением небольших доз минеральных азотных удобрений — не более 45 кг/га. На хорошо окультуренных почвах использование ризоторфина исключает необходимость внесения минерального азота под все виды бобовых.

Инокуляция бобовых клубеньковыми бактериями особенно эффективна на площадях, где ранее не возделывалась данная бобовая культура и соответствующие специфичные бактерии в почве отсутствуют. В почве после посева бобовых клубеньковые бактерии сохраняют высокий титр до 5 лет.