НОВЫЕ ТИПЫ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ВАКЦИН

Или, например, предложен способ получения различных суперкапсид- ных частиц (таких как у RS-вируса) и получение таким образом вирусомы неоличающихся по иммуногенности от нативных вирусных оболочек.

ДНК-вакцины и перспективы их использования в ветеринарии

Вирусные белки, синтезированные в микроорганизмах, не стали вакцинами субъединичного типа. Они оказались недостаточно иммуногеиными. Так, например, гемагглютинин вируса гриппа в составе вириона находится в виде тримера, который образуется из мономерных полипептидов в клетках животных. Иммуногенность гемагглютинина в составе цельных вирионов в 100 раз выше иммуногенности свободного гемагглютинина и в 100000 раз выше таковой мономерного полипептида, синтезированного в бактериях. Вероятно конформация свободного и вирионного гемагглютинина и мономерного полипептида сильно различается. Мономерный полипептид VP1 вируса ящура в 1000000 раз менее иммуногенен, чем эквивалентное количество пептида в составе вириона. Таким образом, вирусные вакцины, созданные на основе белков, синтезированных в микроорганизмах, неконкурентноспособны по сравнению с цельновирионными вакцинами.

В последние 5 лет создано новое направление в разработке генноинженерных вакцин, основанное на введении плазмидной ДНК (вектора) с встроенным геном протективного белка непосредственно в организм животного. Иммунизацию плазмидной ДНК с чужеродным геном называют ДНК-вакцинацией (генетической иммунизацией, вакцинацией нуклеиновыми кислотами, вакцинацией «голой» ДНК).

Плазмидная ДНК представляет собой кольцевую ковалентно-замкнутую молекулу длиной 4-6 тысяч пар нуклеотидов. В ней имеется участок, ответственный за начало транскрипции (промотор), ген протективного белка, ген, обеспечивающий устойчивость клеток к антибиотику (ампициллину) и участок начала репликации плазмидной ДНК. В качестве промоторов используют регуляторные участки генома цитомегаловируса человека, обезья- него вируса 40 и вируса саркомы Рауса. Репликация плазмидной ДНК происходит только в бактериальных клетках, тогда как транскрипция гена протективного белка осуществляется только в клетках млекопитающих. Плаз- мидную ДНК реплицируют в клетках кишечной палочки в присутствии ампициллина, очищают и вводят внутримышечно животным в дозе Ю10 - 1012молекул. Плазмидная ДНК поглощается клетками животных в небольшом количестве (0,01-1,0%), а большая часть ее быстро разрушается. Проникшая в клетку ДНК транспортируется в ядро и транскрибируется клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразой с образованием информационной

РНК, которая в цитоплазме обеспечивает синтез протективного белка. Плазмидная ДНК длительное время (до 3-6 мес) функционирует в клетках. В организме животного плазмидная ДНК не размножается, не встраивается в хромосомы и на нее не образуются антитела. Синтезированный в клетках протективный белок расщепляется на цитоплазматических протеосомах на короткие пептиды (8-10 аминокислот). Последние с молекулами главного комплекса гистосовместимости класса 1 (ГКГС1) и транспортируются к клеточной поверхности.

Механизм воздействия ЦТЛ на клетку - мишень состоит в следующем. Лимфоцит прикрепляется к клетке и из него путем экзоцитоза выделяется специальный белок перфорин, который образует поры в мембране клетки- мишени. После выделения перфорина лимфоцит отсоединяется от клетки и способен к взаимодействию с другой клеткой-мишенью. Действие СД8+- ЦТЛ стимулируется СД4+-Т-хелперами 1-го типа посредством продукции ими цитокинов -медиаторов межклеточных взаимодействий. Цитокины Т- хелперов 1-го типа способствуют в основном развитию клеточного иммунного ответа, а цитокины Т-хелперов 2-го типа стимулируют гуморальный иммунный ответ.

Синтезированный протективный белок может транспортироваться из клетки в межклеточное пространство в свободном нерасщепленном состоянии. Он связывается с антиген презенгирующими клетками (макрофагами), проникает в них путем эндоцитоза и расщепляется в эндосомах на короткие фрагменты (10-20 аминокислот). Фрагменты белка объединяются с молекулами главного комплекса гистосовместимости класса 11 (ГКГС 11) и встраиваются в поверхностную мембрану клетки. На поверхности клетки комплексы антиген + молекулы ГКГС 11 распознаются СД4+- Т-хелперов типа 2 превращаются в антителопродуцирующие клетки. Таким образом, плазмидная ДНК с встроенным геном протективного белка индуцирует у животных полноценный гуморальный и клеточный иммунный ответ.

Первые работы по экспрессии в организме животных вирусных генов, встроенных в плаз мид ную ДНК, были опубликованы в 1993 г. У ДНК- содержащих вирусов встроенный в плазмиду ген представляет собой участок геномной ДНК, а у РНК- содержащих вирусов -ДНК- транскрипт участка геномной РНК, полученный с помощью обратной траискриптазы.

Американские исследователи из лабораторной фирмы «Мегск» показали, что внутримышечное введение мышам плазмидной ДНК, содержащей ген белка нуклеокапсида 1ЧР вируса гриппа А (НШ1), приводит к образованию специфических антител и ЦТЛ. Антитела к белку NP не обладают протек- тивными свойствами. А ЦТЛ защищают 90% животных' от последующего заражения не только гомологичным (H1N1), но и гетерологичным (H3N2), штаммами вируса гриппа А.

Двукратная иммунизация 3-нед цыплят плазмидной ДНК, содержащей ген гемагглютинина Н7 вируса гриппа А, обеспечивает защиту 50-60% цыплят от интраназального введения 100 летальных доз вирулентного вируса гриппа (H7N7). В контрольной группе гибель цыплят составляет 98%. Исследования по влиянию различных способов введения плазмидной ДНК, содержащей ген гемагглютинина Н1 вируса гриппа А, на защиту от контрольного заражения были проведены американскими исследователями на 6-8 нед мышах. Подкожное, интраназальное, внутрикожное, внутривенное и внутримышечное введение плазмидной ДНК в дозе 50-22 мкг приводит к защите 67-95% мышей Интраперитональное введение не сопровождается развитием иммунного ответа. Заслуживают внимания результаты по так называемому баллистическому методу введения (gene gun), когда частички золота диаметром 1-2 мкм, покрытые плазмидной ДНК, с помощью специального устройства доставляются в клетки кожи. Доза плазмидной ДНК составляет всего 0,4 мкг, а защита мышей от контрольного заражения достигает 95%.

Успешно проведены исследования по разработке ДНК-вакцины против бешенства. Двукратная внутримышечная иммунизация мышей плазмидной ДНК, экспрессирующей гликопротеин вируса бешенства, приводит к полноценному гуморальному (синтез ВНА) и клеточному (образование ЦТЛ) иммунному ответу и защищает животных от контрольного заражения вирулентным штаммом вируса бешенства. В последние 3 года широко ведутся исследования по разработке различных ДНК-вакцин. Два года назад в США была проведена конференция под названием «ДНК-вакцины: новая эра в вакцинологии». Новый подход дает возможность на базе одного плазмид- ного вектора конструировать различные ДНК-вакцины. Меняют только ген, кодирующий протективный белок. ДНК-вакцины обладают безопасностью инактивированных вакцин и эффективностью живых. К настоящему времени сконструированы ДНК- вакцины против ряда вирусных, бактериальных и паразитарных болезней. В одну плазмидную ДНК можно встраивать гены протективных белков нескольких возбудителей и гены цитокинов - регуляторов иммунного ответа. Эффективность иммунизации ДНК-вакцинами очевидна, однако, потребуется еще много усилий для практической реализации нового подхода к профилактике инфекционных болезней животных (Орлянки Б.Г. С/х биол.,1995,1996, 1998).