ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)

Данный метод дает возможность регистрировать продукты ПЦР непосредственно в ходе реакции и получать калибровочные графики для процесса амплификации, происходящего в каждой отдельной пробирке во время каждого цикла на протяжении всего времени проведения анализа.

ПЦР в реальном времени (ПЦР-РТ) — более быстрый и чувствительный метод диагностики фитопатогенов, по сравнению с классическим ПЦР. Он дает информацию не только о присутствии, но и о количестве патогена в исследуемом образце непосредственно после этапа амплификации и не требует отнимающей дополнительное время стадии электрофоретического разделения продуктов. Специфичность ПЦР-РТ анализа иногда оказывается выше, чем у альтернативных вариантов ПЦР, что позволяет различать последовательности, отличающиеся по одной паре оснований, например, для того, чтобы выявлять устойчивые к фунгицидам штаммы и отличать их от восприимчивых. Разработаны методики ПЦР-РТ, при которых вся процедура проходит в закрытой системе, что предотвращает контаминацию и получение и ложно-положительных результатов.
Для ПЦР-РТ используют флуоресцентные зонды и специальное оборудование. Амплификацию проводят в приборе, снабженном устройством для освещения пробирок светом с длиной волны, возбуждающим флуоресценцию, и многоканальным флуоресцентным детектором, позволяющим изме-

рять уровень флуоресценции в каждой пробирке. Флуоресцентный зонд 89 может быть либо включен в амплифицируемый фрагмент, либо, напротив, освобождаться в реакционную смесь в процессе амплификации. Если необходимо анализировать несколько разных ДНК-мишеней, можно использовать зонды, связанные с различными флуоресцентными красителями.
Существует несколько способов детекции продукта ПЦР-РТ. При наиболее простом из них применяют интеркалирующий флуоресцентный краситель, в частности SYBRgreen (рис. 3.3-1). Однако, этот способ имеет существенный недостаток: краситель будет в равной степени окрашивать как специфический (определяемый), так и неспецифический ампликон, если последний будет образовываться в результате реакции.
Другой, пожалуй наиболее распространенный способ, основан на применении флуоресцентного зонда типа TaqMan (рис. 3.4). TaqMan-зонды представляет собой последовательность из 25-30 олигонуклеотидов, меченных с 5-конца флуорофором (обычно производным флуоресцеина, например, 6-карбоксифлуоресцеином / 6-FAM), а с 3-конца — гасителем флуоресценции (чаще всего родаминовым красителем TAMRA). Taq-полимераза, которая достраивает новую цепь ДНК, обладает 5 -З'эндонуклеазной активностью в отношении двуцепочечных фрагментов ДНК, которые она устраняет, отщепляя один или несколько нуклеотидов. Поскольку наряду с флуорофором к олигонуклеотидному зонду присоединен гаситель, в начале амплификации наблюдается лишь незначительная эмиссия. По мере того, как фермент наращивает цепь, он расщепляет зонд. Флуорофор освобождается от соседства с гасителем и переходит в раствор. В результате чего флуоресценция усиливается и может быть измерена. Уровень флуоресценции, и соответственно, измеряемый сигнал, возрастает пропорционально количеству образующегося ампликона.
При создании зондов, построенных по типу молекулярных биконов и Scorpion™, также используют принцип пространственного разделения флуорофора и гасителя (рис.

3.3-2). Эти зонды сконструированы таким образом, что образуют структуру, напоминающую шпильку, в которой гаситель и флуорофор крепятся к концевым нуклеотидам «шпильки». Когда гаситель и хромофор расположены в непосредственной близости, флуоресценция зонда поглащается гасителем. Во время отжига происходит гибридизация зонда с целевым фрагментом ДНК, после чего за счет пространственного разделения флуорофора и гасителя, регистрируется флуоресценция.
Другой, относительно более новый, тип зонда — FRET-зонд, использующий перенос энергии резонанса флуоресценции (рис. 3.3-3). В этом случае детекция осуществляется с помощью двух разных зондов, помеченных двумя разными флуорохромами, один из которых способен передавать свою энергию возбуждения другому, когда флуорохромы находятся на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. Сближение двух флорохромов приводит к гашению флуоресценции первого и возбуждению флуоресценции второго. Флуоресциенция излучающего флуорохрома








возрастает пропорционально количеству вновь синтезированной ДНК, что позволяет прослеживать процесс амплификации ДНК-мишени. FRET довольно редко применяется для диагностики фито патогено в, пока его применение ограничено случаями, когда требуется очень высокий уровень специфичности определения.
В последние годы, ПЦР в реальном времени широко применяют для практических целей в фитопатологии. Ряд книг и обзоров полностью или частично посвящен данному методу и его применению для детекции и идентификации фитопатогенов. Он используется при диагностике болезней растений в полевых условиях, в том числе тех, возбудителями которых, являются наиболее вредоносные и карантинные патогены, особенно когда необходима быстрая и точная их идентификация. Например, вируса пятнистого увядания томата, потивируса сливы, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Phytophthora infestans,

92 Р citricola, Septoria tritici, Puccinia recondita, Я striiformis, Tilletia indica, Phomopsis longicola, Rhizoctonia solani. Разработаны протоколы ПЦР в реальном времени для анализа генов, участвующих в токсигенезе у продуцирующих трихотеценовые микотоксины грибов рода Fusarium и образующих афлатоксины видов Aspergillus.
ПЦР в реальном времени относительно прост в исполнении и не требует больших временных затрат. Процесс анализа полностью автоматизирован, что позволяет проверять большое количество образцов в одном эксперименте. На сегодняшний день для проведения ПЦР в реальном времени доступен целый ряд приборов, в том числе и портативных.
Наряду с преимуществами относительно классического ПЦР-анализа у метода ПЦР в реальном времени есть общие с ним ограничения. Например, оба вида ПЦР определяют не только живые, но и мертвые клетки или свободную ДНК, что иногда может привести к ошибкам при выяснении причин возникновения болезни. 

Еще по теме ПЦР в реальном времени (Real-time PCR):

1. 9-9. Реальные свидетельства факта эволюции
2. ОЦЕНКА СОСТАВА МЕТАНОГЕННЫХ АРХЕЙ В ТОРФЯНЫХ ПОЧВАХС ПОМОЩЬЮ ПЦР-ДГГЭ ТЕХНОЛОГИИ А.              К. Кизилова, М. В. Чистотин, И. К. Кравченко
3. 9-1* В разных временах
4. Временный березовый тип
5. 10* He ко времени
6. ВО МРАКЕ ВРЕМЕН
7. ВНУТРИПОЧВЕННЫЙ ВРЕМЕННЫЙ БОКОВОЙ СТОК
8. Динамика численности популяции во времени. 
9. 21.2.2. Насекомые — временные кровососущие паразиты
10. Собаки-поводыри известны с древних времен…
11. Первые «расчеты» времени происхождения человека