Иммуноферментный сорбционный анализ - ELISA

Антитела
Антитела являются ключевым компонентом ELISA, обеспечивающим его чувствительность и специфичность. Антитела (иммуноглобулины или у-глобулины), которые иммунная система млекопитающих образует в ответ на внедрение чужеродного организма или введение чужеродных макромолекул, представляют собой гликопротеины.

В принципе, для выявления фитопатогенов с помощью ELISA возможно использовать антисыворотку иммунизированного животного (называе-




мую также иммунной сывороткой), которая содержит антитела к их антигенам, но согласно общепринятой практике, предварительно антитела выделяют из антисыворотки, а для приготовления конъюгатов с ферментами обязательно используют выделенные и очищенные антитела. Независимо от того, применяется ли ELISA для качественной или количественной диагностики, он нуждается в высокоспецифичных и чувствительных антителах.
В зависимости от особенностей структуры, антигенных и биологических свойств иммуноглобулины разделяются на несколько классов. Обычно в ELISA используют иммуноглобулины класса G (IgG) или их фрагменты (наиболее часто Fab-фрагмент). Молекула IgG состоит из двух легких и двух тяжелых цепей, соединенных дисульфидными связями (рис. 3.1). Каждая из цепей имеет в своем составе константные (CHI, СН2, СНЗ, CL) и вариабельные (VH и VL) области. Фермент папаин расщепляет молекулу IgG на три фрагмента по месту шарнирной зоны. Два фрагмента, называемые Fab, несут гипервариабельные последовательности, ответственны за связывание с антигенами и контролируют его специфичность. Фрагмент Fc содержит константные области. Поскольку эти фрагменты не утрачивают функции, которые они выполняли, входя в состав молекулы, их, используют в некоторых вариантах ELISA вместо целых антител.
Основным свойством специфичных антител, в значительной степени определяющим успех ELISA, является их аффинность, которая характеризует прочность связывания активных центров молекулы антитела с распознаваемым и связываемым (детерминантным) сайтом антигена. Аффинность зависит от взаимной пространственной комплементарности антиген- связывающего центра антитела и антигенной детерминанты (или эпитопа): чем выше их комплементарность, тем выше аффинность.
Для иммунодиагностики фитопатогенов используют антитела, полученные разными способами.

Поликлональные антитела (polyclonal antibodies — pABs). Сыво- 59 ротки от иммунизированных животных обычно представляют собой смесь сходных, но не идентичных антител, продуцируемых множеством лимфоцитов. Такие антитела принято называть поликлональными. Поэтому антисыворотка, полученная к какому-либо иммуногену (в качестве которого может выступать неочищенный экстракт биомассы фитопатогена или отдельные вещества, специально выделенные из его состава) содержит гетерогенную популяцию антител, способных взаимодействовать с разными детерминантами данного иммуногена.
Поликлональные антитела много и успешно используют для иммунодиагностики фитопатогенных вирусов, бактерий и грибов. Получение поликлональных антител представляет собой относительно простую и не слишком дорогостоящую процедуру, которая может быть выполнена за 3-4 месяца. Кроме того, способность связываться с неидентичными антигенами детерминантами является преимуществом, если диагностируют патоген из природной популяции, в которой антигенная конфигурация может довольно значительно варьировать. В этом случае применение pABs дает шанс «перекрыть» биологическое разнообразие данного патогена. Однако специфичность pABs не всегда оказывается достаточно высокой, что приводит к перекрестному взаимодействию с нецелевыми антигенами (обычно из родственных микроорганизмов или вирусов). Этот недостаток отчасти препятствует практическому применению pABs для обнаружения некоторых вирусов, бактерий и, особенно, грибов. Концентрация целевых pABs в антисыворотке невысока. Доля антител, специфичных к гомологичному антигену, составляет всего 5-10% от общего иммуноглобулина, а их аффинность может изменяться от партии к партии. Одним из способов устранить нежелательные перекрестные реакции с посторонними антигенами является частичная очистка pABs.

Ее проводят путем абсорбирования полученной поликлональной антисыворотки гетерологичными антигенами (так называемого истощения) или посредством сильного разбавления высоко- титражных антисывороток, чтобы свести к минимуму или удалить перекре- стно-реагирующие компоненты и снизить уровень фоновой реакции, сохраняя при этом достаточно высокий уровень специфического взаимодействия. Другой способ повышения специфичности — использование моноклональных антител.
Моноклональные антитела (monoclonal antibodies — mABs) представляют собой популяцию антител с высокой специфичностью к одному эпитопу. Моноклональные антитела образуются гибридомами — гибридными клетками, у которых способность производить высокоспецифичные антитела сочетается со способностью быстро размножаться in vitro. Технология получения mABs и ее принципы подробно изложены во многих доступных учебниках, монографиях, обзорах и методических статьях. В общих чертах она состоит в том, что лимфоциты иммунизированных мышей гибридизируют с культивируемыми в среде опухолевыми клетками этих животных (миелобластами). Затем, в процессе пассажей гибридом отбира-
60 ют клоны, образующие антитела с нужной специфичностью. Принципиальным отличием моноклональных антител от поликлональных является их стандартная специфичность к определенному эпитопу, которая воспроизводится при пассажах. Чрезвычайно высокий уровень специфичности mABs, позволяет выявлять очень тонкие различия у близкородственных штаммов или серотипов вирусов и микроорганизмов. Моноклональные антитела однородны не только по своей специфичности, но и по другим биологическим и физико-химическим свойствам (авидности, стабильности, аффинности).
В фитопатологии mABs прежде всего стали применять для иммунодиагностики вирусов. Сейчас их используют также в ELISA других фитопатогенов — бактерий, грибов, фитоплазм и оомицетов. Например, с помощью mABs в составе зооспор и цист фитопатогенных оомицетов удалось обнаружить как общие, так и отличные антигены. Во многих случаях дифференциация вирусных штаммов, бактериальных серотипов, а также рас и изолятов грибов с помощью mABs оказывается более успешной, чем при участии pABs. В то же время требуется известная осмотрительность при использовании mABs с целью обнаружения и идентификации фитопатогенов. Из-за своей высокой специфичности эти антитела могут не распознать тот или иной природный штамм или изолят, если в результате мутации строение эпитопа, к которому специфичны данные антитела, изменилось. С другой стороны, при наличии общих антигенов, как это, например, имеет место у разных серотипов вируса желтой карликовости ячменя, mABs оказываются недостаточно специфичными.
Гибридомная технология делает возможным получение любых количеств mABs к разнообразным антигенам. Это, в свою очередь, позволяет производить коммерческие диагностические препараты для обнаружения, идентификации фитопатогенов и количественной оценки зараженности растений с помощью ELISA.
Антитела, экспонированные на поверхности фага (метод phage displayed antibodies). На основе достижений молекулярной биологии и генной инженерии была разработана новая технология производства антител, при которой нет необходимости иммунизировать животных и получать антисыворотки. Амплифицированные фрагменты иммуноглобулинов, содержащие вариабельные домены с гипервариабельными последовательностями, ответственными за специфичность антител, встраиваются в оболочечный белок на поверхности бактериофага. Данная технология позволяет создавать библиотеки функциональных фрагментов антител различных животных. Это дает практически неограниченный ресурс для получения антител к большому числу самых разных антигенов, так как из библиотек, представленных на поверхности фага, почти всегда можно подобрать фрагмент с нужной специфичностью или найти подходящие специфичности для создания рекомбинантного антитела. Описаны примеры использования этой техники для диагностики поражающих растения вирусов, бактерий и грибов ( Ward et al., 2004; Ziegel, Torrance, 2002).

Еще по теме Иммуноферментный сорбционный анализ - ELISA:

1.   ГЛАВА 9 ИММУНОФЕРМЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОРМОНОВ
2. Анализ ситуаций
3. Анализ по С.П. Мартынову
4. 14.3.6. Корреляционный анализ растительности
5. Анализ моделей и сценариев
6. Анализ среды обитания животных
7.   КЛИНИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МОЧИ  
8. Анализ по А.В. Кильчевскому и Л.В. Хотылёвой
9. Функциональный анализ роста
10.   ОТБОР И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ КРОВИ К АНАЛИЗУ
11. Анализ растений
12.   МЕТОДЫ ОБЩЕГО КЛИНИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КРОВИ  
13. БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЯВЛЕНИЙ ПАРАЗИТИЗМА